Authors:	Galvanin, Adeline
Title:	Use of high-throughput sequencing for the characterization of extracellular RNA and to study the dynamics of bacterial RNA modification
Online publication date:	13-Jan-2020
Year of first publication:	2020
Language:	english
Abstract:	For less than a decade, high-throughput sequencing became a very powerful, sensitive and precise technique for the study of ribonucleic acids. During my PhD thesis, I have used this technology for in-depth characterization of the extracellular RNA (exRNA) content of human plasma. exRNA in plasma exists either in a “soluble state” as a component of ribonucleoprotein (RNP) complexes or encapsulated into extracellular vesicles (EV) of diverse origins (exosomes, microvesicles, …). In this project, I have demonstrated that whole human plasma contains mostly micro RNAs and the fragment of RNA hY4, as well as degraded ribosomal RNA. Moreover, using a rigorous strategy via size exclusion chromatography or consecutive proteinase K/RNase A treatments, highly purified EVs can be obtained. miRNAs and RNA hY4 fragments were nor present in majority of samples, demonstrating a huge difference between soluble exRNA and exRNA from purified EVs. The RNA content of these EVs mainly reflects RNA composition of human microbiota. In addition, I have also performed a comparative analysis of commercially available “exosome-enrichment” kits which supposed to purify human exosomes by precipitation. RNA composition of such fractions was found to be almost identical to human plasma, showing strong uncontrolled contamination by soluble RNPs. Based on this study, we were able to propose a protocol for studies in exRNA in the field of liquid biopsies with clinical sample in order to discover new diagnostic biomarkers. Apart from the characterization of RNA, high-throughput sequencing can be used for detection and quantification of RNA post-transcriptional modifications. During my PhD thesis I have applied deep sequencing for analysis of transfer RNA (tRNA) 2’-O-methylations in model bacteria (E. coli) using RiboMethSeq. Under several stress conditions, such as starvation and non-lethal antibiotics concentrations, some 2’-O-methylated nucleotides show an adaptive response. While over than half of Gm18 show a global increase under all investigated stress conditions, ribomethylated residues at position 34 show an opposite effect for some antibiotic treatments: mostly for chloramphenicol and streptomycin. Each of these dynamic profiles can be linked to cell regulation in response to stress. Change at the tRNA wobble base (position 34) could be a way to regulate translation by modifying the codon usage. Concerning Gm18, its role in the escape from the human innate immune system during host invasion is currently elucidated. Für weniger als ein Jahrzehnt wurde die Hochdurchsatzsequenzierung zu einer sehr leistungsfähigen, sensitiven und präzisen Technik für die Untersuchung von Ribonukleinsäuren. Während meiner Doktorarbeit habe ich diese Technologie zur eingehenden Charakterisierung des Gehaltes an extrazellulärer RNA (exRNA) in menschlichem Plasma verwendet. exRNA im Plasma liegt entweder in einem "löslichen Zustand" als Bestandteil von Ribonukleoprotein (RNP) -Komplexen vor oder ist in extrazellulären Vesikeln (EV) unterschiedlicher Herkunft (Exosomen, Mikrovesikel,…) eingekapselt. In diesem Projekt habe ich gezeigt, dass gesamtes menschliches Plasma hauptsächlich Mikro-RNAs und das Fragment der RNA hY4 sowie abgebaute ribosomale RNA enthält. Darüber hinaus können unter Verwendung einer rigorosen Strategie mittels Größenausschlusschromatographie oder aufeinanderfolgenden Proteinase K / RNase A-Behandlungen hochgereinigte EVs erhalten werden. miRNAs und RNA-hY4-Fragmente waren in der Mehrzahl der Proben nicht vorhanden, was einen großen Unterschied zwischen löslicher exRNA und exRNA von gereinigten EVs zeigt. Der RNA-Gehalt dieser EVs spiegelt hauptsächlich die RNA-Zusammensetzung menschlicher Mikrobiota wider. Darüber hinaus habe ich auch eine vergleichende Analyse von im Handel erhältlichen Kits zur "Exosomenanreicherung" durchgeführt, mit denen menschliche Exosomen durch Ausfällung gereinigt werden sollen. Es wurde festgestellt, dass die RNA-Zusammensetzung solcher Fraktionen fast identisch mit menschlichem Plasma ist und eine starke unkontrollierte Kontamination durch lösliche RNPs zeigt. Basierend auf dieser Studie konnten wir ein Protokoll für exRNA-Studien im Bereich der Flüssigbiopsie mit klinischer Probe vorschlagen, um neue diagnostische Biomarker zu entdecken. Neben der Charakterisierung von RNA kann die Hochdurchsatzsequenzierung zum Nachweis und zur Quantifizierung von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen verwendet werden. Während meiner Doktorarbeit habe ich eine Tiefensequenzierung zur Analyse von Transfer-RNA (tRNA) 2'-O-Methylierungen in Modellbakterien (E. coli) mit RiboMethSeq durchgeführt. Einige 2'-O-methylierte Nukleotide reagieren unter verschiedenen Stressbedingungen, wie Hunger und nicht-letalen Antibiotika-Konzentrationen, adaptiv. Während mehr als die Hälfte von Gm18 unter allen untersuchten Stressbedingungen einen globalen Anstieg zeigt, zeigen ribomethylierte Rückstände an Position 34 für einige Antibiotika-Behandlungen einen gegenteiligen Effekt: hauptsächlich für Chloramphenicol und Streptomycin. Jedes dieser dynamischen Profile kann als Reaktion auf Stress mit der Zellregulation verknüpft werden. Eine Veränderung an der tRNA-Wobble-Base (Position 34) könnte ein Weg sein, die Translation durch Modifizieren der Codonverwendung zu regulieren. In Bezug auf Gm18 wird derzeit seine Rolle bei der Flucht aus dem angeborenen Immunsystem des Menschen während der Invasion des Wirts aufgeklärt.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3595
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000032474
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	167 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen