Authors:	Girr, Philipp
Title:	Molecular Properties of Water-Soluble Chlorophyll Protein: Implications for its Biological Function
Online publication date:	12-Dec-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Water-soluble chlorophyll proteins (WSCPs) from Brassicaceae are unusual chlorophyll (Chl)-binding proteins in several respects. While all other Chl-binding proteins of higher plants are membrane bound and contain a large number of Chls as well as carotenoids, WSCPs are water-soluble and bind a limited number of Chl molecules and no carotenoids. Their biological function remains enigmatic, although functions as protease inhibitor, as Chl and/or Chl derivative carrier, and as a source of reactive oxygen species have been proposed. In this thesis, a potential function as protease inhibitor was investigated using recombinant WSCP from Arabidopsis thaliana (AtWSCP), which reportedly inhibits papain-like cysteine proteases. However, the misfolding of WSCP apoprotein made it impossible to identify the inhibitory domain of AtWSCP and to describe the molecular mechanisms of protease inhibition. Furthermore, the interaction between WSCP and the thylakoid membrane was investigated, from which WSCP apoprotein can extract Chl molecules. Slow and inefficient extraction of Chl from the thylakoid membrane by WSCP apoprotein suggests that WSCP apoprotein does not directly interact with Chl-binding proteins, which are embedded in the thylakoid membrane and bind the vast majority of the Chl molecules in the thylakoid membrane. More likely, WSCP apoprotein interacts directly with lipid bilayers that contain the thylakoid membrane lipids MGDG, DGDG or PG, and can extract Chl from those, whereas it does not interact with PC membranes. WSCP-Chl complexes are not able to interact with membranes anymore, suggesting that a ring of hydrophobic amino acids with two conserved Trp residues around the Chl binding site plays a central role in the WSCP-membrane interaction and in the Chl uptake by WSCP. In addition to the Chl binding from membranes, the tetrapyrrole specificity of various versions of WSCP was studied in the present work. Titrations and time-resolved CD measurements allowed to determine KD values and kinetic parameters for the binding of Chl a/b, chlorophyllide a/b and pheophytin a/b. The Chl a/b selectivity in WSCP is thermodynamically controlled. Chl b binding is preferred when a hydrogen bond can be formed between the C7 formyl of the chlorine macrocycle and the protein, whereas Chl a is preferred when Chl b binding is sterically unfavorable. Overall, Chl is bound with higher affinities than chlorophyllide or pheophytin, which indicates that the phytol chain and the central Mg2+ ion are important interaction sites between WSCP and tetrapyrrole. Pheophorbide, which lacks both phytol chain and the central Mg2+ ion, can only be bound as pheophorbide b to a WSCP, which has a higher affinity for Chl b than Chl a. This suggests that the hydrogen bond between WSCP and C7 formyl is another important interaction for tetrapyrrole binding to this WSCP. Moreover, WSCP was able to bind the porphyrins protochlorophyllide and Mg-protoporphyrine IX, indicating that the size of the π electron system of the macrocycle and the presence of a fifth ring at the macrocycle do not noticeably affect the binding to WSCP. Surprisingly, also heme can be bound to WSCP, which suggests that the type of central ion is insignificant for the WSCP-tetrapyrrole interaction. Finally, the potential of WSCP-bacteriochlorophyll (BChl) complexes for an application as photosensitizer in photodynamic therapy (PDT) was explored in this thesis. PDT makes use of photosensitizers that upon illumination produce reactive oxygen species like singlet oxygen in order to induce cell death in tumor cells or pathogenic microorganisms. The WSCP-BChl complex exhibits several properties that are advantageous for an application in PDT. The complex exhibits a strong light absorption at 770 – 780 nm, where light penetration into tissue is maximal, and produces considerable amounts of singlet oxygen upon illumination, but also shows a high photo and heat stability, which makes WSCP-BChl an interesting candidate for usage in PDT. Wasserlösliche Chlorophyll-Proteine (WSCPs) aus Brassicaceae sind in mehrfacher Hinsicht ungewöhnliche Chlorophyll(Chl)-bindende Proteine. Während alle anderen Chl-bindenden Proteine höherer Pflanzen membrangebunden sind und eine große Anzahl von Chl- sowie Carotinoid-Moleküle enthalten, sind WSCPs wasserlöslich und binden eine begrenzte Anzahl von Chl-Molekülen und keine Carotinoide. Ihre biologische Funktion ist bislang unklar, es wurden jedoch mögliche Funktionen als Protease-Inhibitor, als Chl- und/oder Chl-Derivat Transporter und als Quelle für reaktive Sauerstoffspezies vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurde eine mögliche Funktion des rekombinantem WSCP aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP) als Proteaseinhibitor untersucht, da dieses Papain-ähnliche Cysteinproteasen hemmt. Jedoch konnte das AtWSCP-Apoprotein nicht gefaltet werden, was es unmöglich machte die inhibitorische Domäne von AtWSCP zu identifizieren und die molekularen Mechanismen der Proteasehemmung zu beschreiben. Außerdem wurde die Interaktion zwischen WSCP und der Thylakoidmembran untersucht, aus der WSCP-Apoprotein Chl-Moleküle extrahieren kann. Eine langsame und ineffiziente Extraktion von Chl aus der Thylakoidmembran durch WSCP-Apoprotein lässt vermuten, dass WSCP-Apoprotein nicht direkt mit anderen Chl-bindendem Proteinen interagiert, welche in die Thylakoidmembran eingebettet sind und fast alle Chl-Moleküle in der Thylakoidmembran binden. Im Gegensatz dazu interagiert WSCP-Apoprotein direkt mit Lipiddoppelschichten, die die Thylakoidmembranlipide MGDG, DGDG oder PG enthalten, und kann Chl aus diesen extrahieren, jedoch kann es nicht mit PC-Membranen interagieren. WSCP-Chl-Komplexe können nicht mehr mit Membranen interagieren, was darauf hindeutet, dass ein Ring aus hydrophoben Aminosäuren mit zwei konservierten Trp-Resten um die Chl-Bindungsstelle eine zentrale Rolle bei der WSCP-Membran-Interaktion und bei der Chl-Aufnahme durch WSCP spielt. Neben Chl-Bindung aus Membranen wurde in der vorliegenden Arbeit die Tetrapyrrolspezifität verschiedener Versionen des WSCP untersucht. Titrationen und zeitaufgelöste CD-Messungen ermöglichten die Bestimmung von KD-Werten und kinetischen Parametern für die Bindung von Chl a/b, Chlorophyllid a/b und Phäophytin a/b. Die Chl a/b-Selektivität in WSCP wird thermodynamisch gesteuert. Die Bindung von Chl b wird bevorzugt, wenn eine Wasserstoffbrücke zwischen dem Chlorin-Makrozyklus und dem Protein gebildet werden kann, wohingegen Chl a bevorzugt wird, wenn die Bindung von Chl b sterisch ungünstig ist. Insgesamt wird Chl mit höheren Affinitäten gebunden als Chlorophyllid oder Phäophytin, was darauf hinweist, dass die Phytolkette und das zentrale Mg2+-Ion wichtige Bindestellen zwischen WSCP und Tetrapyrrol sind. Phäophorbid, dem sowohl die Phytolkette als auch das zentrale Mg2+-Ion fehlen, kann nur als Phäophorbid b an ein WSCP gebunden werden, welches eine höhere Affinität für Chl b als für Chl a aufweist. Dies deutet darauf hin, dass die Wasserstoffbrücke zwischen WSCP und dem C7-Formyl eine weitere wichtige Wechselwirkung darstellt für Tetrapyrrolbindung an dieses WSCP. Darüber hinaus konnte WSCP die Porphyrine Protochlorophyllid und Mg-Protoporphyrin IX binden, was darauf hinweist, dass die Größe des π-Elektronensystems des Makrozyklus und die Anwesenheit eines fünften Rings am Makrozyklus die Bindung an WSCP nicht merklich beeinflussen. Überraschenderweise kann auch Häm an WSCP gebunden werden, was darauf hindeutet, dass der Typ des Zentralions für die WSCP-Tetrapyrrol-Bindung unerheblich ist. Schließlich wurde in dieser Arbeit das Potenzial von WSCP-Bacteriochlorophyll (BChl) -Komplexen für eine Anwendung als Photosensibilisator in der photodynamischen Therapie (PDT) untersucht. PDT verwendet Photosensibilisatoren, die bei Belichtung reaktive Sauerstoffspezies wie Singulettsauerstoff produzieren, um den Zelltod in Tumorzellen oder pathogenen Mikroorganismen zu induzieren. Der WSCP-BChl-Komplex weist mehrere Eigenschaften auf, die für eine Anwendung in der PDT vorteilhaft sind. Der Komplex mit einer starken Lichtabsorption bei 770 - 780 nm, wo Licht am tiefsten in Gewebe eindringen kann, erzeugt bei Beleuchtung beträchtliche Mengen an Singulettsauerstoff, zeigt jedoch auch eine hohe Photo- und Hitzestabilität, was WSCP-BChl zu einem interessanten Kandidaten macht für die Verwendung in der PDT.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3581
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000032139
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VIII, 132 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen