Überexpression und Charakterisierung des extrazellulären Teils der humanen alpha-Sekretase ADAM10
Files
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
License
Abstract
„ÜBEREXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG DES
EXTRAZELLULÄREN TEILS
DER HUMANEN alpha-SEKRETASE ADAM10“
ALEXANDRA LEPTICH
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei enzymatisch aktive lösliche Proteinvarianten der humanen
alpha-Sekretase ADAM10 in Insektenzellen exprimiert, gereinigt und charakterisiert. Dabei entsprach eine
der löslichen ADAM10-Varianten dem extrazellulären Bereich des Typ-I-Membranproteins, d.h. ihr
fehlte die Transmembran- und cytoplasmatische Domäne. Die zweite Variante stimmt mit einer im
menschlichen Gehirn auf mRNA-Ebene nachgewiesenen Splicevariante überein, die zusätzlich noch
durch das Fehlen der Cystein-reichen Domäne gekennzeichnet ist. Die alpha-Sekretase ADAM10 spielt
eine wichtige Rolle bei der nicht-amyloidogenen Prozessierung des Amyloid-Vorläufer-Proteins
(APP). Dabei erfolgt dessen Spaltung innerhalb der beta-Amyloidsequenz, so dass die Produktion von
Abeta-Peptiden und damit die Bildung von Amyloid-Plaques während der Alzheimer’schen Erkrankung
verhindert wird.
Nach der Expression
der beiden löslichen ADAM10-Proteine in Insektenzellen erfolgte die
Reinigung der prozessierten und damit reifen Enzymform der jeweiligen ADAM10-Proteinvariante
mittels Lektin-Affinitätschromatographie.
Die anschließende Charakterisierung der beiden löslichen ADAM10-Proteine erfolgte durch
einen auf HPLC-Analyse basierenden Enzymtest. Dabei wurden verschiedene sich von der
beta-Amyloid-Sequenz ableitenden Peptidsubstrate in vitro eingesetzt, die zum einen den Aminosäuren
11-28 der Abeta-Sequenz, zum anderen dem kompletten Abeta40-Peptid entsprachen und damit die
charakteristische alpha-Sekretasespaltstelle des Amyloid-Vorläufer-Proteins enthielten. Des Weiteren
kamen jeweils entsprechende Peptidsubstrate zum Einsatz, die an den Positionen 21 und 22 der Abeta-
Peptidsequenz vorkommenden Mutationen trugen.
Die gewählten Abeta-Substrate konnten durch die löslichen Varianten der alpha-Sekretase ADAM10 an
der alpha-Sekretasestelle gespalten werden. Dabei konnte bei den Abeta11-28-
Peptiden deutlich die in der
Literatur beschriebene Abhängigkeit der Spaltung von der a-helicalen Struktur des Substrats
beobachtet werden, während bei den längeren Abeta40-Peptide diesbezüglich kein Zusammenhang
hergestellt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ADAM10 hauptsächlich als
alpha-Sekretase wirkt, weniger als ein Abeta-degradierendes Enzym. Ferner konnte unter Verwendung
entsprechender muriner und humaner Abeta-Peptide eine verstärkte Spaltung der murinen Substrate
Abeta1-28 und Abeta1-40 durch den extrazellulären Teil von ADAM10 in vitro gezeigt werden. Dieser
Versuch bestätigt die Annahme, dass es bei Nagetieren durch die Bevorzugung der nichtamyloidogenen
Prozessierung von APP durch die alpha-Sekretase ADAM10 zu keiner Bildung von
Amyloid-Plaques kommt. Ein Einfluss auf die Spaltung von membrangebundenem APP und damit der
Bildung von neuroprotektivem sAPPalpha durch die löslichen ADAM10-Proteine konnte im Zellsystem
nicht beobachtet werden.
Vielmehr scheint hier die Membranverankerung von Enzym und Substrat
eine wichtige Voraussetzung zu bilden. Des Weiteren konnten die löslichen ADAM10-Proteine durch
ein für die Inhibierung von ADAM10 spezifische Hydroxamat-Derivat in ihrer enzymatischen
Aktivität gehemmt werden.
Die exprimierten ADAM10-Proteine weisen die charakteristischen Eigenschaften der alpha-Sekretase
ADAM10 auf, wobei deutlich wurde, dass das Fehlen der Cystein-reichen Domäne keinen Einfluss
auf die Fähigkeit der katalytischen Domäne zur Substrat- und Inhibitorbindung hatte. Auch die
Stabilität des Enzyms wurde durch das Fehlen der Domäne nicht negativ beeinträchtigt.
Eine wichtige Aufgabe stellt nun der Nachweis der löslichen ADAM10-Proteine sowie die
Identifizierung ihrer potentiellen Substrate und deren Lokalisation in vivo dar.