Authors:	Linker, Katrin
Title:	Post- transkriptionelle Regulation der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase
Online publication date:	22-Feb-2006
Year of first publication:	2006
Language:	german
Abstract:	Die Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) wird sowohl über transkriptionelle als auch über post-transkriptionelle Mechanismen reguliert. Dabei spielt die Modulation der iNOS-mRNA-Stabilität durch RNA-bindende Proteine eine bedeutende Rolle. In dieser Arbeit konnte eine Beteiligung des p38-MAPK-Signaltransduktionsweges sowie der RNA-bindenden Proteine TTP, KSRP, HuR und PTB an der Regulation der iNOS-Expression dargestellt werden. Hemmung der p38-MAPK führte zu einer Reduktion der iNOS-mRNA-Expression, hatte aber keinen Effekt auf die iNOS-Promotoraktivität. Das RNA-bindende Protein Tristetraprolin (TTP) erhöhte die Stabilität der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation, ohne jedoch mit ihr zu interagieren. Die Proteinexpression von TTP war unter dem Einfluss von Zytokinen erhöht; Inhibition der p38-MAPK verursachte eine Verminderung der Zytokin-stimulierten TTP-Expression. Das „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) übte einen destabilisierenden Effekt auf die iNOS-mRNA aus. Der Abbau der mRNA wird dabei wahrscheinlich durch eine Zytokin-unabhängige Interaktion von KSRP mit dem Exosom vermittelt. Ebenso konnte zwischen KSRP und TTP eine Wechselwirkung beobachtet werden, die nach Induktion der iNOS-Expression mit Zytokinen verstärkt und durch p38-MAPK-Inhibitoren hemmbar war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA-3’-UTR für die Vermittlung des destabilisierenden Effekts essentiell ist. Eine genaue Lokalisierung der KSRP-Bindungsstelle ergab, dass KSRP ebenso wie HuR mit dem AU-reichen Element am 3’-Ende der 3’-UTR interagiert. KSRP und HuR sind in der Lage, um diese Bindungsstelle zu konkurrieren. Nach Zytokin-Stimulation war dementsprechend die endogene Bindung von KSRP an die iNOS-mRNA vermindert, während die endogene Bindung von HuR an die iNOS-mRNA verstärkt war. Die Stabilisierung der iNOS-mRNA nach Zytokin-Stimulation ergibt sich demnach aus einer Verminderung der Bindung des KSRP-Exosom-Komplexes an die iNOS-mRNA als Folge der verstärkten Interaktion von TTP und KSRP. Dies ermöglicht parallel eine vermehrte Bindung von HuR an die iNOS-3’-UTR und führt damit zu einer Stabilisierung der iNOS-mRNA und so letztendlich auch zu einer Erhöhung der iNOS-Expression. Außerdem konnte eine Beteiligung des Polypyrimidin-Trakt-bindenden Proteins (PTB) an der Regulation der humanen iNOS-Expression gezeigt werden. PTB erhöhte die Expression der iNOS und interagierte Zytokin-unabhängig mit KSRP. Zusammenfassend lässt sich schließen, dass ein Zusammenspiel verschiedener Proteine in einem komplexen Netzwerk für die fein abgestimmte Regulation der humanen iNOS-Expression auf post-transkriptioneller Ebene verantwortlich. The expression of the human inducible nitric oxide synthase (iNOS) is regulated both by transcriptional and post-transcriptional mechanisms. For post-transcriptional regulation of iNOS expression modulation of mRNA stability plays an important role. It could be demonstrated that the p38-MAPK signal transduction pathway and the RNA binding proteins TTP, KSRP, HuR and PTB are involved in the post-transcriptional regulation of iNOS expression. Inhibition of the p38-MAPK resulted in a reduction of iNOS mRNA expression but not iNOS promoter activity. The RNA binding protein tristetraprolin (TTP) stabilized iNOS mRNA after cytokine stimulation without binding to it. TTP expression was enhanced after cytokine treatment. Inhibition of the p38-MAPK resulted in a reduction of the cytokine-stimulated TTP expression. The „KH-type splicing regulatory protein" (KSRP) showed a destabilizing effect on the iNOS mRNA. The degradation of the iNOS mRNA is most likely mediated by cytokine-independent interaction of KSRP with the exosome. KSRP and TTP also displayed an interaction which was increased by cytokine stimulation and could be reduced by p38-MAPK inhibition. In addition it could be demonstrated that binding of KSRP to the iNOS mRNA is essential for its destabilizing effect. Mapping of the exact binding site revealed an interaction of KSRP with the most 3’-located ARE in the iNOS-3’-UTR. This is also the binding site for HuR, an iNOS stabilizing protein. It could be shown that KSRP and HuR compete for this binding site. After cytokine treatment intracellular binding to the iNOS mRNA was reduced for KSRP and enhanced for HuR. In conclusion, stabilization of the iNOS mRNA after cytokine treatment results from an enhanced interaction of TTP and KSRP that leads to a dislodgement of the KSRP-exosome-complex from the iNOS mRNA. In parallel, binding of HuR to the iNOS-3’-UTR is increased. This facilitates stabilization of the iNOS mRNA and as a consequence increases iNOS expression. Moreover an involvement of the polypyrimidine tract binding protein (PTB) in the regulation of iNOS expression was shown. PTB was able to enhance iNOS expression and displayed a cytokine-independent interaction with KSRP. According to these findings, an interplay of different RNA binding proteins in a complex network seems to be essential for the fine-tuned post-transcriptional regulation of human iNOS expression.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch. FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3504
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-9589
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen