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Authors: Rosenthal, Cindy
Title: Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina
Online publication date: 11-Sep-2007
Language: german
Abstract: Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.
Perakine Reductase (PR) is a highly specific enzyme in Rauvolfia serpentina, which enzymatic und molecular reaction mechanism is still unknown. The enzyme is involved in the biosynthesis of monoterpenoid indole alkaloids by performing NADPH2-dependent reduction of perakine to raucaffrinoline. To elucidate the threedimensional structure the gene coding for PR was identified, heterologously expressed and the pure enzyme solution crystallized. PR is a monomeric protein and consists of 337 amino acids with a molecular weight of 37.2 kDa. The purification was performed by means of Ni2+-NTA-affinity chromatography and yielded 10 mg homogenous protein per liter bacteria culture. After expression in E. coli an enzyme assay confirmed the reduction of perakine. The end product was identified through mass spectrometry as raucaffrinoline. However, PR can also reduce cinnamic aldehyde and some of its derivatives. Sequence alignments lead to the conclusion that PR belongs to aldo-keto reductase enzyme superfamily (AKR). After heterologous expression of a triple mutant of PR in E. coli, crystals of the purified and through reductive methylation altered enzyme were obtained by the hanging-drop vapour diffusion technique at 293 K with 100 mM sodium citrate (pH 5.6) and 27% PEG 4000 as precipitant. The structure of the PR could be completely solved with a diffraction of 2.0 Å via molecular replacement. It features the typical (α/β)8 TIM-barrel of all AKRs, conserved amino acids, which are involved in the binding of NADPH2 and mediates over a catalytic tetrad the hydrogen transfer of NADPH2 to the carbon of the substrate.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3389
URN: urn:nbn:de:hebis:77-13850
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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