Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3358
Authors: Klawitter, Sabine
Title: Regulation der Sphingosinkinase 1 und 2 und der neutralen Ceramidase in renalen Mesangiumzellen der Ratte
Online publication date: 7-Aug-2007
Language: german
Abstract: In den letzten Jahren gewann die Erforschung des Sphingolipidstoffwechsels in den verschiedensten Zellsystemen immer mehr an Bedeutung, da es sich zeigte, dass einige Sphingolipidspezies, vor allem Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat, als wichtige intra- und extrazelluläre Botenstoffe wirken und bei einer Vielzahl unterschiedlicher zellulärer Antworten, wie Apoptose, Proliferation und Migration, eine wichtige Rolle spielen. Während Ceramid eher pro-apoptotisch und wachstumshemmend wirkt, begünstigt Sphingosin-1-Phosphat als „Gegenspieler“ eher die Proliferation und das Zellwachstum. Ceramid kann relativ schnell in Sphingosin-1-Phosphat umgewandelt werden durch die Wirkung zweier Enzymklassen, den Ceramidasen und den Sphingosinkinasen. Konsequenterweise ist die Regulation dieser Enzyme von entscheidender Bedeutung für das zelluläre Gleichgewicht zwischen Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Wirkung von extrazellulären Nukleotiden, die ebenfalls als Regulatoren zahlreicher zellulärer Antworten, wie z.B. Proliferation und Migration, bekannt sind und über entsprechende Oberflächenrezeptoren, die Purinrezeptoren, wirken, auf die Aktivität besonders der Sphingosinkinasen 1 und 2 näher untersucht. Es sollte geklärt werden, ob die Sphingosinkinasen an einigen durch extrazelluläre Nukleotide induzierbaren zellulären Antworten, in diesem Falle der Migration und der Proliferation von Zellen, beteiligt sind. Als Zellsystem wurden Nierenmesangiumzellen verwendet, da diese Zellen bei verschiedenen entzündlichen Nierenerkrankungen (Glomerulonephritiden) eine wichtige Rolle spielen. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass extrazelluläre Nukleotide die Aktivität der Sphingosinkinase 1 in den Mesangiumzellen stimulieren können. Zu beobachten ist dabei eine biphasische Aktivitätssteigerung der Sphingosinkinase 1. Die erste Aktivitätssteigerung nach einer Kurzzeitstimulation ist dabei auf eine Phosphorylierung des Enzyms zurückzuführen, während die zweite Aktivitätssteigerung mit einer Aktivierung des Sphingosinkinase 1-Promotors, einer verstärkten mRNA-Expression und einer de novo Proteinsynthese zu erklären ist. Diese Induktion kann durch die Verwendung von Hemmstoffen des PKC- und MAPK-Signalweges, sowie durch Verwendung eines Transkriptions- (Actinomycin D) oder eines Translationsinhibitors (Cycloheximid) blockiert werden. Die Halbwertszeit der mRNA der Sphingosinkinase 1 in den Mesangiumzellen konnte auf ca. 20 Minuten bestimmt werden. Im Gegensatz dazu ist die Sphingosinkinase 2 nicht durch ATP aktivierbar, wohl aber durch diverse Abbauprodukte von ATP, wie AMP und Adenosin, sowie durch UTP und seine Abbauprodukten UDP und UMP. Die neutrale Ceramidase kann nicht durch ATP und UTP aktiviert werden, wohl aber durch P2X7-Rezeptoragonisten (Bz-ATP, αβ-Me-ATP, γS-ATP) und TPA. In einem zweiten Schritt wurde die Rolle der Sphingosinkinasen und der neutralen Ceramidase bei der durch extrazelluläre Nukleotide induzierten Migration und Proliferation untersucht. Es zeigte sich mit Hilfe von genspezifischer siRNA zur Depletion der Sphingosinkinasen und der neutralen Ceramidase, sowie durch Verwendung von Kinase-Hemmstoffen und damit einhergehend der Inhibierung der Signalwege und mit Hilfe von verschiedenen Zelllinien isoliert aus Wildtyp-, SPHK 1-überexprimierenden und mSPHK1-defizienten Mäusen, dass die Aktivierung der Sphingosinkinase 1 durch extrazelluläre Nukleotide von entscheidender Bedeutung für die Migrationsfähigkeit der Zellen ist, jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Proliferationsrate der Mesangiumzellen hat. Auch die Aktivität der neutralen Ceramidase ist von entscheidender Bedeutung für die Migrationsfähigkeit der Zellen. Durch Depletion der neutralen Ceramidase scheint Ceramid in den Zellen zu akkumulieren, was die Proliferationsrate reduziert. Für die Proliferation der Mesangiumzellen könnte die Sphingosinkinase 2 als negativer Regulator fungieren, wie die Experimente mit der genspezifischen siRNA unter UTP-Stimulation gezeigt haben. Für die Migration der Mesangiumzellen gilt darüber hinaus, dass auch das Produkt der Sphingosinkinase 1, Sphingosin-1-Phosphat, in der Lage ist, die Migration zu stimulieren. Im Gegensatz dazu spielt Sphingosin-1-Phosphat für die Induktion der Proliferation der hier verwendeten Zellen keine wesentliche Rolle. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass die Sphingosinkinase 1 und vorgeschaltet auch die neutrale Ceramidase bei der Migration von Mesangiumzellen eine zentrale Rolle spielen und damit als therapeutische Angriffspunkte bei der Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte Migration gekennzeichnet sind, in Frage kommen.
During the last years sphingolipids gained a lot of interest in mainy different cellular systems because it became more and more obvious that some sphingolipids, espacially ceramide and sphingosine-1-phosphat, act as intracellular second messengers and play an important role in a variety of cellular responses, like apoptosis, proliferation and migration. Whereas ceramide acts in a pro-apoptotic fashion as an inhibitor of proliferation, sphingosine-1-phosphat as its counterpart induces proliferation and cell growth. Ceramide itself can easily be converted by ceramidases and sphingosine kinases into sphingosine-1-phosphate. Consequently, the regulation of these enzyme classes is of greatest importance for the cellular balance between ceramide and sphingosine-1-phosphate (“rheostat model”). This thesis mainly focusses on the effect of extracellular nucleotides, which are also known to be regulators for diverse cellular responses like proliferation and migration by acting on a special subset of membrane receptors (purinoceptors), on the activity especially of sphingosine kinase 1 and 2. We wanted to investigate, if sphingosine kinases are involved in the regulation of some cellular responses induced via application of extracellular nucleotides (migration and proliferation). The cellular system used in this investigation are renal mesangial cells which are known to play a crucial role in several kidney diseases, espacially in glomerulonephritis. We could show that extracellular nucleotides induce the activity of sphingosine kinase 1 in our cellular system. This activation occurs in a biphasic manor. The first peak of activity occurs within minutes after stimulation and is caused by a phosphorylation of sphingosine kinase 1. The second, more delayed peak of activation is due to the activation of the sphingosine kinase 1 promoter and enhanced mRNA synthesis followed by de novo protein synthesis. This induction can be blocked by the use of inhibitors of the PKC- and MAPK signaling cascades as well as by using transcriptional (actinomycin D) or translational inhibitors (cycloheximide). The halflife of sphingosine kinase 1 mRNA was determined to be around 20 minutes. In contrast to that, sphingosine kinase 2 can not be induced by ATP but by diverse breakdown products of ATP, like AMP and adenosine, as well as with UTP, UDP and UMP. The neutral ceramidase can be activated by several P2X7 receptor agonists (Bz-ATP, αβ-Me-ATP, γS-ATP) and TPA. In a second step the role of the sphingosine kinases and the neutral ceramidase in the regulation of migration and proliferation induced by extracellular nucleotides was investigated. We could show by using inhibitors of several signaling pathways as well as by using genspecific siRNA to deplete the enzymes or different genetically modified cell lines (wt, sphingosine kinase 1 overexpressing, mSPHK 1-/-) that the activation of sphingosine kinase 1 is crucial for the induction of migration by extracellular nucleotides, but not for the proliferation. Depletion of the neutral ceramidase also leads to a reduced migration and proliferation of the cells, probably because of the accumulation of ceramide inside the cells. Sphingosine kinase 2 seems to be a negative regulator in UTP induced migration. Also the product of sphingosine kinase 1, sphingosine-1-phosphate, is able to induce migration in renal mesangial cells. Taken together, our data show that sphingosine kinase 1 and neutral ceramidase play a pivotal role in the migratory response of renal mesangial cells and therefore might be important therapeutical targets for the treatment of diseases which are characterized by an enhanced migration of this type of cells.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3358
URN: urn:nbn:de:hebis:77-13475
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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