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Authors: Nillius, Dorothea
Title: Aktivierung von Hämocyanin zur Tyrosinase
Online publication date: 9-Jul-2007
Language: german
Abstract: Ziel der Arbeit war die enzymatische Aktivierung von Cheliceraten-Hämocyanin zur Erforschung ihrer Phenoloxidase-Aktivität. Hierzu wurden zwei Hämocyanine in vergleichenden Untersuchungen herangezogen: Das bekannte 24-mer aus der Spinne Eurypelma californicum und das ebenfalls 24-mere Hämocyanin des Skorpions Pandinus imperator, dessen Struktur hier aufgeklärt wurde. Elektronenmikroskopisch und in der dynamischer Lichtstreuung sind sich beide Hämocyanine sehr ähnlich und sedimentieren bei analytischer Ultrazentrifugation ebenfalls in gleicher Weise (Sedimentationskoeffizient von 37 S (S20, W)). Durch Dissoziation im alkalischen Milieu gewinnt man bis zu zwölf Untereinheiten, von denen sich neun immunologisch unterscheiden lassen. Das absorptionsspektroskopische Verhalten von P. imperator- und E. californicum-Hämocyanin sowie Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie ist nahezu identisch. Die Stabilität des Hämocyanins gegenüber Temperatur und Denaturierungsmitteln wurde mit Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie sowie durch die enzymatische Aktivität untersucht. Erstmals konnten die Hämocyanine von P. imperator und E. californicum nicht nur zu einer stabilen Diphenoloxidase umgewandelt werden, sondern auch eine Monophenolhydroxylase-Aktivität induziert und reguliert werden. Für letztere Aktivität ist dabei die Präsenz von Tris- oder Hepes-Puffer wesentlich. Während sich die Monophenolhydroxylase-Aktivität nur auf Ebene der oligomeren Zustände beobachten lässt, erkennt man bei den isolierten Untereinheiten-Typen lediglich eine Diphenoloxidase-Aktivität. Bei dem Spinnen-Hämocyanin zeigen die Untereinheiten bc die stärkste katalytische Aktivität auf, bei P. imperator-Hämocyanin findet man drei bis vier Untereinheiten, die enzymatisch aktiv sind. Die Aktivierung mit SDS liefert den Hinweis, dass die Quartärstruktur in eine andere Konformation gebracht und nicht durch SDS denaturiert wird. Zugabe von Mg2+ reguliert die Phenoloxidase-Aktivität und verschiebt bei P. imperator-Hämocyanin die enzymatische Aktivität zugunsten der Diphenoloxidase. Mit keiner der zur Verfügung stehenden Methoden konnte jedoch ein Konformationsübergang eindeutig nachgewiesen werden. Die Stabilität scheint durch die niedrigen SDS-Konzentrationen nicht beeinträchtigt zu werden. Die sehr lange “Verzögerungsphase“ bei der Monophenolhydroxylase-Aktivität konnte durch Zugabe von katalytischem Diphenol drastisch verkürzt werden, was ein Hinweis auf die echte Tyrosinase-Aktivität des aktivierten Hämocyanins ist. Ein in vivo-Aktivator konnte bis jetzt noch nicht gefunden werden. Trotzdem scheinen die Hämocyanine in der Immunologie von Cheliceraten eine bedeutende Rolle zu spielen, indem sie die Rolle der Tyrosinasen / Phenoloxidasen beziehungsweise Catecholoxidasen übernehmen, die bei Cheliceraten nicht vorkommen. Weitere Möglichkeiten des Cheliceraten-Immunsystems, eindringende Fremdorganismen abzuwehren, wurden untersucht. Das Fehlen einer ´echten` Phenoloxidase-Aktivität bei den Cheliceraten, mit der Fähigkeit, sowohl mono- als auch diphenolische Substrate umzusetzen, stützt die Hypothese, dass aktiviertes Hämocyanin in vivo an die Stelle der Phenoloxidase tritt.
Aim of this study was the enzymatic activation of chelicerate hemocyanin and the exploration of their phenol oxidase activity. Two hemocyanins were consulted in comparative studies: The well-known 24-meric hemocyanin of the tarantula Eurypelma californicum and the likewise 24-meric hemocyanin of the scorpion Pandinus imperator. The structure of the latter was elucidated. Concerning electron microscopy and dynamic light scattering, both hemocyanins are quite similar. They sediment in similar manner in the analytical ultracentrifuge (sedimentation coefficient 37 S (S20, W)). Dissociation in alkaline medium leads up to twelve subunits, nine of them are immunological distinguishable. Absorption spectroscopy and secondary structure analysis yield to similar results. The stability of the hemocyanin against temperature and denaturing agents was examined with circular dichroism spectroscopy and fluorescence spectroscopy as well as by checking the enzymatic activity. For the first time the hemocyanins of E. californicum and P. imperator could not only be converted to a stable diphenol oxidase, but also a monophenol hydroxylase activity could be induced and regulated. For the latter the presence of Tris or Hepes is essential. While monophenol hydroxylase activity can only be observed on the level of oligomeric hemocyanin, the isolated subunits display only diphenol oxidase activity. In the spider hemocyanin the subunits bc have the strongest enzymatic activity. In the scorpion hemocyanin three to four subunits are enzymatically active. The activation with SDS delivers the indication that the quaternary structure is turned into a different conformation, and that no denaturing by SDS occurs. Addition of Mg2+ regulates the phenol oxidase activity and adjusts the enzymatic activity of P. imperator hemocyanin in favour of the diphenol oxidase. However, with no available method a conformational change could be definitely verified. The protein stability doesn’t seem to be altered by the low SDS concentration. The very long “lag phase” of the monophenol hydroxylase activity could be drastically decreased by catalytic amounts of diphenol. This is a hint towards the ´real` tyrosinase activity of the activated hemocyanin. Until now, an in vivo activator could not yet been found. Nevertheless, the hemocyanins seem to play a crucial role in the immunity of chelicerates. They take over the role of tyrosinases / phenol oxidases respectively catecholoxidases / diphenol oxidases, which do not exist in chelicerates. Further possibilities of the chelicerate immune system to fend off penetrating foreign organisms were examined. The lack of a ´real` tyrosinase activity in chelicerates and the ability to convert both monophenolic and diphenolic substrates supports the hypothesis that activated hemocyanin takes over the place of phenol oxidase in vivo.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3342
URN: urn:nbn:de:hebis:77-13298
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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