Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3299
Authors: Haugwitz, Martin
Title: Analyse der Molekularstruktur von Arthropoden-Hämocyaninen (2x6-mer, 4x6-mer, 8x6-mer) mit 3D-Elektronenmikroskopie
Online publication date: 23-Feb-2017
Language: german
Abstract: Bei den kupferhaltigen Hämocyaninen der Arthropoden handelt es sich um große, extrazelluläre respiratorische Proteine, die sich aus mehreren Untereinheitentypen zusammensetzen, und Hexamere (1x6-mere) bzw. Oligohexamere (2x6-mer, 4x6-mer, 6x6-mer, 8x6-mer) bilden. Für detaillierte Aussagen über die Funktionsweise bei der reversiblen O2-Bindung dieser Proteine benötigt man genaue Kenntnisse über deren dreidimensionale Struktur. Für die Aufklärung der Quartärstruktur eines solch großen Proteins ist die 3D-Elektronenmikroskopie hervorragend geeignet, da sie detaillierte 3D-Rekonstruktionen liefert. Damit wurden in dieser Arbeit die Quartärstrukturen von drei unterschiedlichen Arthropoden-Hämocyaninen erstellt und analysiert. Für das 8x6-mere Hämocyanin des Pfeilschwanzes Limulus polyphemus wurden zwei 3D-Rekonstruktionen erstellt. Die erste 3D-Rekonstruktion besitzt eine Auflösung von 7,3 Å und stellt den deoxygenierten Zustand des respiratorischen Proteins dar. Die zweite 3D-Rekonstruktion des 8x6-mers zeigt den oxygenierten Zustand des Proteins und besitzt eine Auflösung von 7,9 Å. Die strukturellen Unterschiede zwischen beiden 3D-Rekonstruktionen wurden genauer untersucht und analysiert. Durch das flexible Einpassen von Homologiemodellen der verschiedenen Untereinheitentypen in die entsprechenden 3D-Rekonstruktionen konnten die Kontaktstellen, die zwischen den Hexameren des 8x6-mers auftreten, genauer als früher beschrieben und erstmalig Unterschiede beider Konformationszustände ermittelt werden. Für zwei Kontaktstellen wurden molekulardynamische Simulationen durchgeführt, um Näheres über die Interaktion der beteiligten Aminosäuren zu erfahren. Für das 4x6-mer des Maulwurfskrebses Callianassa truncata wurde eine 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 4,9 Å erstellt. Diese erlaubte es, die Kontaktstellen der vier Hexamere mit Hilfe von Homologiemodellen der beiden Untereinheitentypen genauer zu untersuchen. Die vier hier beschriebenen Kontaktstellen wurden zusätzlich mit Hilfe molekulardynamischer Simulationen analysiert. Die 3D-Rekonstruktion des 2x6-mers der Meeresassel Ligia oceanica erreichte eine Auflösung von 8,6 Å und erbrachte neue Erkenntnisse über die ungewöhnliche Assemblierung der beiden Hexamere und über die strukturelle Verwandtschaft der verschiedenen Crustaceen-Hämocyanine.
Arthropod hemocyanins are very large extracelluar respiratory proteins. They consist of several types of 75 kDa subunits, each containing a binuclear copper active site for reversible oxygen binding. The basic quaternary structure of arthropod hemocyanins is a hexamer (1x6-mer), but in the hemolymph of most species a characteristic type of oligo-hexamer predominates (2x6-mer, 4x6-mer, 6x6-mer, 8x6-mer). Many arthropod hemocyanins show a very high cooperativity of oxygen binding. In order to study this cooperativity at the level of single amino acids, and notably the allosteric force transfer at the inter-hexamer contacts, detailed information about the quaternery structure is required. 3D-electron microscopy of cryo-fixed proteins is the relevant method to determine the quaternary structure of such large proteins. In the present thesis I used this technique to reveal, in cooperation with others, the quaternary structure of three different arthropod hemocyanins in detail. In my first project, we established 3D-reconstructions of the oxy and the deoxy state of the 8x6-mer hemocyanin from the horseshoe crab Limulus polyphemus. The two 3D-reconstructions have resolutions of 7.3Å (deoxy state) and 7.9Å (oxy state), respectively. To analyze conformational changes at the inter-hexamer interfaces, atomistic homology models of the seven different subunit types were flexibly fitted into the corresponding 48 subunit positions of both 3D-reconstructions. The two resulting atomistic models of the 8x6-mer were then used to describe, for the first time at this structural level, conformational chances occuring during oxygenation and deoxygenation. Molecular dynamics simulations were applied to further substantiate the results. In my second project, we produced a 3D-reconstruction at 4.9Å resolution of the unique 4x6-mer hemocyanin from the ghost shrimp Callianassa truncata. This high resolution enabled producing, by flexible fitting, the first reliable atomistic homology model of this hemocyanin type. Additional molecular dynamics simulations revealed new insights in the structure and stability of the molecular interfaces between the hexamers of this 4x6-mer. Moreover, I obtained a 3D-reconstruction of the authentic 2x6-mer half-molecule which turned out to be very similar to the typical 2x6-mer of Brachyuran crabs. In my third project, we produced a 3D-reconstruction at 8,6Å resolution of the 2x6-mer hemocyanin from the marine isopod Ligia oceanica. Its unusual mode of inter-hexamer assembly, which is also found in Callianassa hemocyanin, is discussed in the framework of crustacean hemocyanin evolution.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3299
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000010134
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XIV, 231 Seiten
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