Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3263
Authors: Naumann, Steffen
Title: Untersuchungen zum Mechanismus der Zytotoxizität von alkylierenden Agenzien in malignen Melanomzellen
Online publication date: 11-Feb-2009
Language: german
Abstract: Maligne Melanome sind gegenüber Chemotherapeutika relativ resistent. Das methylierende Alkylanz Temozolomid sowie das chlorethylierende und DNA-Interstrand Crosslink (ICL) bildende Alkylanz Fotemustin kommen bei der Behandlung des malignen Melanoms als Mittel erster Wahl zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal nachgewiesen werden, dass die zytotoxische Wirkung von Temozolomid und Fotemustin in Melanomzellen durch Apoptose vermittelt wird. Unter Verwendung klinisch relevanter Dosen der beiden Alkylantien konnte die Induktion von Apoptose durch vier unabhängige Methoden (Bestimmung der SubG1-Fraktion und der Apoptose- / Nekrose-Frequenz, Aktivierung der Effektorcaspasen-3 und -7 sowie Spaltung von PARP-1) nachgewiesen werden. Die Alkylierungen an der O6-Position des Guanins, welche durch beide Agenzien induziert werden, sind auch in Melanomzellen die wichtigsten Zytotoxizität-bewirkenden Läsionen in der DNA, und die O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist folglich ein herausragender Resistenzmarker. Eine der verwendeten Zelllinien (D05) exprimierte p53-Wildtypprotein. Diese Zelllinie war resistenter als alle anderen Zelllinien gegenüber Temozolomid und Fotemustin. Dies weist darauf hin, dass p53 nicht die Apoptoseinduktion in Melanomzellen verstärkt. Die Prozessierung des O6MeG erfolgt über die Mismatch-Reparatur (MMR) unter Generierung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs). Die Untersuchung der durch Temozolomid induzierten DSBs, nachgewiesen durch gammaH2AX-Induktion, korrelierte direkt mit der apoptotischen Antwort von Melanomzelllinien und DSBs können somit als eine entscheidende apoptoseauslösende Größe angesehen werden. Eine Resistenz gegenüber dem methylierenden Temozolomid in der Zelllinie MZ7 konnte auf einen Defekt in der MMR-Schadenserkennung auf der Ebene des MutSalpha-Komplexes zurückgeführt werden. Dieser Defekt hatte keinen Einfluss auf die Fotemustin-vermittelte Apoptoseinduktion. Neben MGMT konnte somit die MMR als Resistenzfaktor gegenüber methylierenden Agenzien in Melanomen identifiziert werden. Die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde in Melanomzelllinien im Detail untersucht. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass Fotemustin-bedingte ICLs in Zellen einen G2/M-Arrest im Behandlungszyklus induzieren. Wie anhand G1-arretierter Zellen nachgewiesen werden konnte, war das Durchlaufen der DNA-Replikation vor Erreichen des Arrests für die Induktion der Apoptose notwendig. Die Prozessierung von ICLs ist im Vergleich zu Methylierungen der DNA deutlich komplexer. Dies könnte erklären, warum in Melanomzellen die durch gammaH2AX-Induktion repräsentierten DSBs nicht mit der Sensitivität der einzelnen Zelllinien korreliert. Die Untersuchung unterschiedlich sensitiver Zelllinien zeigte ein vergleichbares Schadensniveau an ICLs und eine ebenso vergleichbare initiale Prozessierung derselben unter Generierung von DSBs. Die Prozessierung dieser sekundären Läsionen, welche anhand der Abnahme von gammaH2AX-Foci untersucht wurde, war hingegen in der sensitiveren Melanomzelllinie deutlich weniger effektiv. Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass eine uneffektive Prozessierung der sekundären Läsionen einhergeht mit einer verstärkten und länger anhaltenden Aktivierung der in der DSB-Detektion beteiligten Kinase ATM und der Checkpoint Kinase 1. Es wäre daher denkbar, dass eine verstärkte Aktivität dieser Kinasen proapoptotische Signale vermittelt. Unterschiede in der Prozessierung der sekundären Läsionen könnten somit ein wichtiger Marker der ICL-induzierten Apoptose darstellen. Des weitern konnte nachgewiesen werden, dass nach Fotemustingabe die mitochondrial-vermittelte Apoptose einen effektiven Exekutionsweg in Melanomen darstellt. Während Cytochrom C-Freigabe, Bcl-2-Abnahme an den Mitochondrien, Bax-Rekrutierung und Caspase-9 Aktivität nachgewiesen werden konnten, wurden keine Hinweise auf eine Fas-Rezeptor-vermittelte Apoptose gefunden. Die Unfähigkeit, Rezeptor-vermittelte Apoptose zu unterlaufen, könnte die Bedeutungslosigkeit des p53-Gens in Melanomen begründen, da gerade dieser Weg in der Alkylantien-induzierten Apoptose in anderen Zellsystemen eine große Relevanz besitzt. Bei der Suche nach einem alternativen proapoptotischen Signalweg konnten Hinweise für die Beteiligung des Rb/E2F-1-Wegs, welcher über p73 agiert, in einer p53-mutierten Melanomzelllinie gefunden werden. Einen Einfluss der Proteine Survivin und XIAP als Resistenzfaktoren auf die Fotemustin-induzierte Apoptose wurde hingegen nicht nachgewiesen.
Malignant melanomas are highly resistant to chemotherapeutic drugs. First line therapy includes the use of two alkylating drugs. The fist one is the methylating agent temozolomide and the second the chloroethylating and DNA interstrand crosslink (ICL) inducing agent fotemustine. The present thesis showed for the first time that melanoma cells undergo apoptosis following treatment with temozolomide or fotemustine when the drugs were used in therapeutic doses. This observation was confirmed using four independent methods. Temozolomide and fotemustine induce alkyl groups at O6-guanine leading to O6MeG and O6ClEtG respectively. As this is the most important cytotoxic lesion in melanoma cells, O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT) is considered to be an outstanding marker of resistance. One cell line (D05) was shown to express p53-wild type protein. Compared to the other cell lines D05 cells were more resistant to temozolomide and fotemustine treatment indicating that p53 does not play a role for the induction of apoptosis in melanoma cells. Processing of the lesion O6MeG occurs via mismatch repair (MMR) by generating DNA double-strand breaks (DSBs). Temozolomide induced DSB formation, represented by induction of gammaH2AX, correlated significantly with the apoptotic response in melanoma cells. Therefore, DSB formation induced by temozolomide was the prominent apoptotic stimulus in this cell system. One of the cell lines (MZ7) showed a high level of resistance to the methylating agent temozolomide. This was related to a defect in the MMR dependent damage detection by the MutSalpha complex. This defect had no impact on fotemustine induced apoptosis. Therefore besides MGMT, MMR could be identified as a resistance factor for methylating agents in melanoma. Fotemustine induced apoptosis in melanoma cells was studied in more detail. The present thesis showed for the fist time that fotemustine induced ICLs lead to a G2/M arrest in the treatment cell cycle. Using synchronized cells it was shown that the cells need to go through DNA replication before they arrest in G2/M phase to undergo apoptosis. In comparison to methylation damage of the DNA the processing of ICL is more complex. This could explain the observation that DSB formation, determined by gammaH2AX, did not correlate with the apoptotic response in melanoma cells. Using cell lines with differential sensitivity to fotemustine, ICL formation and their initial processing by generation of DSBs was comparable. However the processing of these secondary lesions (determined by gammaH2AX foci) was less effective in the sensitive cell line. The less effective processing of the secondary lesions was paralleled with a stronger and prolonged activation of the DNA damage dependent kinase ATM and the checkpoint kinase 1. This stronger activity of these kinases could be the reason for pro-apoptotic signalling. Therefore differences in processing of the secondary lesions could be an important marker for ICL induced apoptosis. Furthermore it could be demonstrated that fotemustine induced apoptosis in melanoma cells was effectively executed via the mitochondrial apoptosis pathway. This was verified by Cytochrom c release, Bcl-2 decrease at the mitochondria, Bax recruitment and activation of Caspase- 9. On the other hand there was no evidence for Fas receptor mediated apoptosis under these conditions. This was in contrast to investigations on other cell types where DNA alkylation induced apoptosis occurred predominantly by an activation of the Fas receptor pathway. The inability of melanoma cells to undergo Fas receptor mediated apoptosis could be a reason for the insignificance of the p53 gene. By searching for an alternative pro-apoptotic pathway evidence was found for the involvement of the Rb/E2F-1 pathway in a p53 mutated melanoma cell line. An impact of the proteins Survivin and XIAP as resistance factors of fotemustine mediated apoptosis was not found.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3263
URN: urn:nbn:de:hebis:77-18894
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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