Authors:	Löhner, Sabine
Title:	Untersuchungen zur Struktur und Funktion des Vibrio cholerae Cytolysins
Online publication date:	26-Jan-2009
Year of first publication:	2009
Language:	german
Abstract:	Vibrio cholerae Cytolysin (VCC) gehört zur Gruppe der Exotoxine und bildet auf Membranen heptamere transmembrane Poren. VCC wird als protoxin mit einem Molekulargewicht von 79 kDa sezerniert und benötigt die proteolytische Spaltung der N-terminalen Pro-Region um Poren in der Membran zu bilden. Diese Spaltung erfolgt sowohl in Lösung, als auch nach der Bindung an Membranen, aber nur aktiviertes VCC oligomererisiert in eine lytische Pore. Die Kristallstruktur von VCC zeigt, dass das Monomer vier verschiedenen strukturellen Domänen enthält; die cytolytische Domäne, mit der Pre-Stem-Sequenz, der Pro-Region und den beiden C-terminalen Domänen β-Trefoil und β-Prism. Die porenbildende β-Barrel wird aus je einer Pre-Stem Domäne jedes der einzelnen sieben Untereinheiten gebildet. Da sich die porenbildende Region im Monomer zwischen den Domänen β-Prism und β-Trefoil befindet, sind konformationelle Änderungen des Toxins notwendig, um die Insertion dieser Region in die Membran zu ermöglichen. In dieser Arbeit wurde unter anderem der Mechanismus der Porenbildung durch die Konstruktion von Disulfid-Derivaten untersucht. Die Bildung von Disulfidbrücken wurde verwendet, um die porenbildende Region entweder mit der β-Trefoil oder β-Prism Domäne zu verknüpfen. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen bindet das Toxin an Membranen und oligomerisiert zu SDS-labilen Oligomeren. Nach der Reduktion der künstlichen Disulfidbrücke erlangen die gebildeten Oligomere SDS-Stabilität und permeabilisieren die Membran. Durch die Zugabe steigender Konzentrationen des VCC-Derivats zu aktivem Toxin, wird die SDS-Stabilität der gebildeten Oligomere stark reduziert. Die Insertion des aktiven Toxins in die Membran wird allerdings nicht verhindert und daher Poren mit reduziertem funktionellen Durchmesser gebildet. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass die Bildung einer Prä-Pore vor der Insertion des Toxins in die Membran erfolgt und zeigt zum ersten Mal ein solches Zwischenstadium für ein β-porenbildendes Toxin, das von Gram-negativen Organismen produziert wird. Diese Ergebnisse deuten auf einen archetypischen Mechanismus der Porenbildung hin. Zusätzlich wurde die Funktion der beiden C-terminalen Domänen untersucht, und daher verschiedene Deletions- und Substitutionsmutanten konstruiert. Die β-Trefoil Domäne ist nicht essentiell für die Bindung des Toxins an Membranen, ist aber für die korrekte Faltung des Toxins notwendig. Die C-terminale β-Prism Domäne vermittelt die Bindung des Toxins an Membranen über Zuckerrezeptoren. Vibrio cholerae cytolysin ( VCC) is a protein exotoxin that forms SDS-stable heptameric β-barrel trans-membrane pores in mammalian cell membranes. VCC is secreted as a protoxin of 79 kDa (pro-VCC) that requires proteolytic cleavage of an N-terminal fragment in order to attain pore-forming activity. Proteolytic activation can occur both in solution and in the membrane-bound state, and only VCC oligomerizes to form SDS-stable heptamers. The three-dimensional structure of pro-VCC has revealed that VCC contains four different domains; the cytolysin domain including the pre-stem regin, the pro-region and the c-terminal domains β-trefoil and β-prism. The β-barrel comprises the pre-stem domain from each of the seven subunits. In the monomer, the pre-stem domain is sandwiched between the -prism and -trefoil domain and therefore major conformational changes are required for membrane insertion of the pore-forming sequence. In the present study, disulfide bonds were engineered to tie the pre-stem sequence to either the -prism or the -trefoil domain. In their non-reduced form, mutants were able to bind to membranes and to form oligomers; however, these were not resistant to dissociation by SDS and did not form pores. Upon disulfide bond reduction, the mutant oligomers acquired SDS resistance and permeabilized the membrane. Addition of increasing amounts of an inactive mutant to wild-type toxin resulted in formation of mixed oligomers with progressively reduced SDS-stability on membranes. Membrane insertion of active monomers in these hybrid oligomers was still observed, but the functional pore diameter was reduced. These findings indicate that formation of an oligomeric pre-pore precedes the departure of the pre-stem domain from its location in the monomer and demonstrate that pore-formation by VCC follows the same archetypal mode as β-barrel cytolysins of Gram-positive organisms. Additional, the c-terminal domains β-trefoil and β-prism were deleted separately to attain more information about their capacity of membrane binding. This work revealed that β-trefoil is necessary to gain functional active toxin and proper protein folding, but had no implications on membrane binding. The β-prism domain mediates membrane binding to the cell surface via carbohydrate receptors on associated glycoproteins and glycolipids.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3256
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-18776
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen