Authors:	Rost, Martina
Title:	Funktionsanalyse von Gamma2-Adaptin: ein zellulärer Adaptor der Hepatitis-B-Virus-Morphogenese
Online publication date:	23-Dec-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Im Replikationszyklus umhüllter Viren entstehen neue Viruspartikel durch die Knospung an Membranen der Wirtszelle. An diesem Prozess sind verschiedene zelluläre Faktoren und Mechanismen beteiligt, speziell die ESCRT-Proteinkomplexe, welche die Vesikelbildung an den MVBs steuern. Auch bei HBV ist davon auszugehen, dass Komponenten der Wirtszelle an der Umhüllung und Freisetzung der Virionen beteiligt sind, allerdings sind diese noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die zellulären Faktoren genauer zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Virusumhüllung aufzuklären. Den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen bildeten vorangegangene Arbeiten, in denen die spezifische Interaktion des L-Hüllproteins von HBV mit g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese ist für die Morphogenese von HBV essentiell, allerdings ist die zelluläre ebenso wie die virusspezifische Funktion von g2-Adaptin bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, wo und wie g2-Adaptin in der Zelle funktionell ist, um daraus Rückschlüsse auf die Vorgänge bei der Morphogenese von HBV ziehen zu können. Die Grundlage für die Charakterisierung von g2-Adaptin bildete seine Ähnlichkeit zu zellulären Clathrin-Adaptorproteinen. So konnte hier gezeigt werden, dass auch g2-Adaptin ein Clathrin-Bindungsmotiv besitzt, welches eine Interaktion mit Clathrin ermöglicht. Außerdem konnte ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv (UIM) identifiziert werden, das die Bindung an ubiquitinierte Proteine vermittelt. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass g2-Adaptin zu einer Gruppe monomerer Adaptorproteine zählen könnte, welche als Ubiquitin-Rezeptoren in der Zelle funktionell sind. Die folgenden Analysen zeigten eine weitere Gemeinsamkeit, da auch g2-Adaptin selbst durch Ubiquitin modifiziert wird, wobei die Ubiquitinierung von einem intakten UIM abhängt. Dieser als Coupled Monoubiquitination bezeichnete Prozess wird hierbei durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt, die direkt mit g2-Adaptin interagiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die C2-Domäne von Nedd4 ebenfalls mit Ubiquitin modifiziert ist, wodurch der Kontakt zum UIM von g2-Adaptin erfolgt. Die meisten der bislang bekannten Ubiquitin-bindenden Adaptorproteine, spielen bei der Vesikelentstehung an verschiedenen zellulären Membranen eine Rolle, wo sie an der Sortierung der vorwiegend ubiquitinierten Membranproteine beteiligt sind und zelluläre Komponenten rekrutieren, welche die Vesikelabschnürung vermitteln. Die Adaptorproteine sind dabei meist mit der jeweiligen Membran assoziiert, was auch für g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese Membranbindung wird durch den N-terminalen Proteinbereich von g2-Adaptin vermittelt und erfolgt unabhängig von den Ubiquitin-bindenden Eigenschaften und von Nedd4. Allerdings scheint die Ubiquitin-Modifikation von g2-Adaptin ausschließlich in membrangebundener Form zu erfolgen. An welchen Membranen g2-Adaptin lokalisiert ist, wurde in Immunfluoreszenzstudien untersucht, wobei eine enge Assoziation von g2-Adaptin mit späten Endosomen bzw. MVBs zu beobachten war. Bei weiteren Analysen konnte auch ein funktioneller Einfluss auf die Vesikelentstehung an den MVBs nachgewiesen werden, da durch die Depletion von g2-Adaptin stark vergrößerte, defekte MVBs induziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass g2-Adaptin als Ubiquitin-Rezeptor an diesen Prozessen beteiligt sein könnte. Ebenso wie andere Adaptorproteine könnte es hier an die Cargo-Proteine binden, diese durch den Kontakt zu Clathrin lokal konzentrieren und die Vesikelabschnürung durch die Rekrutierung der MVB-Maschinerie vermitteln. Möglicherweise stellt g2-Adaptin hierbei den bislang nicht identifizierten Adaptor dar, der die Verbindung zwischen Nedd4 und der MVB-Kaskade herstellt. Eine ähnliche Funktion für g2-Adaptin ist auch bei der Morphogenese von HBV denkbar. Aufgrund der durchgeführten Lokalisationsstudien ist anzunehmen, dass die Umhüllung der HBV-Partikel direkt an den MVBs erfolgt. Vermutlich bindet g2-Adaptin hier an das L-Hüllprotein, wobei es durch die Rekrutierung von Clathrin zu einer lokalen Anreicherung der Hüllproteine kommt. g2-Adaptin interagiert zudem in UIM-abhängiger Weise mit dem Nukleokapsid, wobei der Kontakt direkt erfolgen könnte oder durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt wird, welche über eine Late-Domäne ebenfalls mit dem Nukleokapsid verbunden ist. Anscheinend gelangt das Nukleokapsid durch den Einfluss von g2-Adaptin und Nedd4 zum Ort der Virusmorphogenese, wo die eigentliche Umhüllung und die Abschnürung der Viruspartikel erfolgen. Vermutlich sind auch hier Komponenten der MVB-Maschinerie beteiligt, die womöglich durch g2-Adaptin rekrutiert werden. Many enveloped viruses complete their replication cycle by budding through a cellular membrane. This process involves several cellular components and mechanisms that are hijacked for the production of viral particles. Especially, the ESCRT-complexes, which promote budding of intraluminal vesicles at the multivesicular bodies (MVB), play an important role. HBV is proposed to abuse host cell factors for budding and release, but details are yet unknown. Therefore, the aim of this study was to identify and characterize cellular components that function during HBV morphogenesis. Former studies in our lab led to the identification of g2-adaptin as a specific binding partner of the HBV large envelope protein. We could demonstrate that this interaction is essentiel for HBV morphogenesis, but the cellular as well as HBV-coupled function of g2-adaptin remained to be established. Therefore the aim of this work was to elucidate, where and how g2-adaptin acts within the cell and during HBV morphogenesis. g2-adaptin originally was identified and characterized based on its homology to the heterotetramer clathrin-adaptor proteins. In support, here I could show that g2-adaptin also contains a clathrin-binding motif, which mediates an interaction with clathrin. Moreover, a ubiquitin-interacting motif (UIM) could be identified, that promotes binding of g2-adaptin to ubiquitinated proteins. This observation indicates that g2-adaptin appears to belong to a group of monomeric adaptor proteins that function as ubiquitin receptors. Further analysis revealed additional similarities, in such that g2-adaptin itself is ubiquitinated, which depends on its UIM-motif. This process refered to as “coupled monoubiquitination” is specifically mediated by the ubiquitin-ligase Nedd4. I could show that Nedd4 binds directly via its C2-domain to g2-adaptin. To do so, the C2-domain is also modified with ubiquitin, which is recognized by the UIM-motif of g2-adaptin. Most of the known ubiquitin-binding adaptor proteins are involved in vesicle formation at cellular membranes, where they sort ubiquitinated cargo proteins and recruit other components required for vesicle budding. Accordingly, the adaptor proteins are mostly associated with the particular membrane. In this work, similar findings could be demonstrated for g2-adaptin. Membrane binding of g2-adaptin is mediated by its N-terminal domain and is independent of its UIM-motif and of its association with Nedd4. The ubiquitination of g2-adaptin exclusively occurs when bound to membranes. Immunofluorescence studies were performed in order to characterize the membranes to which g2-adaptin binds. They revealed a close association of g2-adaptin with late endosomes and MVBs. Further analysis showed that g2-adaptin affected proper vesicle formation at the MVBs, since depletion of g2-adaptin induced enlarged dysfunctional MVBs. Therefore, g2-adaptin appears to be involved in the formation of MVB vesicles. Possibly it may act as an ubiquitin receptor and bind to ubiquitinated cargo molecules destined for intraluminal vesicles. During this process, the interaction of g2-adaptin with clathrin could lead to a local concentration of these cargoes. Subsequent recruitment of ESCRT components would then induce budding of the intraluminal vesicles. Hence g2-adaptin may be one yet undefined adaptor that links Nedd4 to the MVB-pathway. A similar function of g2-adaptin is conceivable for its action during HBV morphogenesis. The envelopment of HBV particles is supposed to take place at MVBs. Presumably, g2-adaptin binds here to the L envelope protein, in order to accumulate it at the site of virus budding. In addition, g2-adaptin interacts with the nucleocapsid in an UIM-dependent manner. The latter contact could either be direct or indirect, mediated by Nedd4, which binds to the late domain of the HBV nucleocapsid. Apparently, the nucleocapsid is directed to the site of virus budding by the action of both, g2-adaptin and Nedd4. The final envelopment and budding of HBV particles is likely mediated by components of the MVB machinery, recruited by g2-adaptin.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3236
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-18490
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen