Authors:	Hilbig, Lydia
Title:	Charakterisierung redundanter Kerntransportsignale des minoren Kapsidproteins L2 humaner Papillomviren
Online publication date:	23-Dec-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Das minore Kapsidprotein L2 humaner Papillomviren wird im Laufe des HPV-Lebenszyklus zweimal in den Zellkern importiert und akkumuliert dort an den Nukleären Domänen 10 (ND10). Der erste Kernimport erfolgt in der frühen Phase der Infektion zusammen mit der Virus-DNA. Für den Zusammenbau von Virionen wird neu synthetisiertes L2-Protein ein weiteres Mal in den Kern transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Domäne von L2 identifiziert werden, die für den Kernimport von HPV16 L2 absolut notwendig ist. Dabei gelang es diesen Bereich auf 25 Aminosäuren einzuengen. Sowohl während der frühen Phase der Infektion als auch während der Morphogenese scheint die zentrale, basische Aminosäureregion 291-315 (mNLS) hauptverantwortlich für die Interaktion mit Kernimportrezeptoren zu sein. Möglicherweise leisten dabei flankierende Sequenzen einen Beitrag zur Stabilisierung der notwendigen Konformation. Des Weiteren gelang die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Funktionalität des mNLS essentiell sind. Hierbei handelt es sich um ein zentrales Arginin-Motiv, bestehend aus vier dicht beieinander liegenden Argininen, dessen Mutation den Kernimport von L2 während Infektion und Morphogenese verhindert. Untersuchungen mit HPV16 und HPV18 L2-Proteinen verdeutlichten, dass es möglicherweise ein universelles Motiv zu sein scheint und in verschiedenen HPV-Typen konserviert ist. Flankiert wird dieses Arginin-Motiv von konservierten Serinen und Threoninen. Wie die Analyse von Punktmutationen zeigte, sind diese Aminosäuren für den Kernimport von L2 ohne Bedeutung. Interessanterweise verhinderte aber die Mutation TS295/6A die Kolokalisation von L2 mit ND10 im Zellkern. L2wt rekrutiert den transkriptionellen Regulator Daxx. Auch diese Funktion ging bei der Mutante TS295/6A verloren. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die ND10-Lokalisationsdomäne (AS 390-420) in L2 sondern auch weitere Aminosäuren oder Domänen für die Assoziation mit ND10 und die Rekrutierung von Daxx verantwortlich sein könnten. Auf der Suche nach zellulären Faktoren, die eine Rolle im mNLS-vermittelten Kernimport spielen, wurde zunächst die Bedeutung von Hsc70 untersucht. Während der Morphogenese maskiert Hsc70 den C-Terminus von L2 und verhindert damit unerwünschte Interaktionen mit Mikrotubuli im Zytoplasma. Es existieren aber weitere noch unbekannte Hsc70-Bindedomänen in L2, die möglicherweise den Kernimport ebenfalls beeinflussen können. Wie die Untersuchungen deutlich machten, ist der zentrale, basische Bereich von L2 aber nicht mit Hsc70 assoziiert und der mNLS-vermittelte Kernimport findet unabhängig von Hsc70 statt. In einem siRNA-Screen wurde anschließend die Rolle von Karyopherinen während der Infektion untersucht. Sowohl Kapß2-siRNA als auch Kapß3-siRNA waren in der Lage unabhängig voneinander die Infektion von HPV16-Pseudovirionen zu reduzieren. Für beide Karyopherine konnte in der Vergangenheit in vitro die Interaktion mit HPV16 L2 nachgewiesen werden. Das L2-Protein ist das einzige virale Protein, das während der Infektion die Virus-DNA in den Kern begleitet (Day et al., 2004). Demzufolge ist es auch das einzige virale Protein, das mit Importinen während der Infektion interagiert. Möglicherweise sind also beide Karyopherine in der Lage sein L2 während der Infektion in den Kern zu importieren. Abschließend wurden Präzipitationsversuche durchgeführt, die zur Identifizierung möglicher Bindungspartner des mNLS führen sollten. In diesen Versuchen konnte eine erhöhte Bindungsaffiniät zu den beiden Importinen Kapß1 und Kapß2 festgestellt werden. Möglicherweise ist das L2-Protein mit seiner mNLS in der Lage mehrere Importrezeptoren zu binden und für den Kernimport zu nutzen. Eines dieser Importine ist Kapß2. Dieser Importrezeptor scheint sowohl bei der Infektion als auch während der Morphogenese den Kernimport von L2 durch die Bindung an das mNLS zu vermitteln. The minor capsid protein L2 of human papillomaviruses enters the nucleus twice during the viral life cycle and accumulates at nuclear domain 10 (ND10) structures. At early stages of the infectious pathway L2 accompanies the viral genome to the nucleus. During the late phase of infection newly synthesized L2 is transported again into the nucleus for capsid assembly. This work revealed a basic region within L2 to be is responsible for nuclear translocation of the HPV16 minor capsid protein. Additionally this region, named mNLS, could be confined to 25 amino acids. During the early infectious pathway as well as during morphogenesis the mNLS (aa 291-315) is mainly responsible for the interaction with nuclear transport receptors. But flanking regions may also contribute to the mNLS sequence. Furthermore, the amino acids which are absolutely essential for the mNLS function could be identified. Mutational analysis revealed that substitutions of 4 closely located arginine residues in the centre of the mNLS motive prevent nuclear translocation. These investigations with HPV16 and HPV18 L2 proteins also pointed out the mNLS is a ubiquitous and conserved motive in different HPV types. The central arginine motive within the mNLS is flanked by serine and threonine residues. But as point mutations made clear these residues have no impact on the nuclear import of L2. In contrast mutation of TS295/6 prohibited accumulation of L2 with ND10 structures and recruiting of the transcriptional regulator Daxx. These results show that not only the ND10 localization domain (aa 390-420) but also other residues contribute to ND10 association. In search for cellular factors which are involved in mNLS mediated nuclear translocation the role of the chaperon protein Hsc70 was investigated initially. During morphogenesis Hsc70 circumvents unwanted interaction of L2 with microtubules by masking the L2 C-terminus. Former investigations revealed that other Hsc70-binding domains exist in L2 beside the C-terminus, which possibly influence nuclear translocation of L2. But like analysis of the mNLS mediated nuclear import display the central, basic Region of L2 is not associated with Hsc70. Furthermore the mNLS mediated nuclear import proceeded even in the absence of Hs70. Next the role of karyopherins during the early infectious pathway was studied with the help of RNA interference. Independent of each other both Kapß2 and Kapß3-siRNA had the ability to reduce the infectivity of HPV16 pseudovirions. Both karyopherins are known to interact in vitro with full length HPV16 L2 and to compete with each other for this binding. L2 is the only HPV protein which accompanies the viral DNA into the nucleus. Therefore it is also the only viral protein which interacts with karyopherins during the early infectious pathway. It is reasonable that both karyopherins, Kapß2 and Kapß3, can mediate nuclear entry of incoming L2 protein. Finally pull down experiments were performed to identify karyopherins which are able to interact with the mNLS motiv of HPV16 L2. These assays revealed an increased binding affinity of the mNLS motive to Kapß1 and Kapß2. Therefore it is possible that the L2 mNLS motive can bind more than one karyopherin. One of these karyopherins is Kapß2. This import receptor may promote nuclear translocation of L2 during the early infectious pathway as well as during morphogenesis via interaction with the mNLS motive of the capsid protein.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3233
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-18463
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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