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Authors: Meesters, Christian
Title: Die Verbindung von Kleinwinkelstreuung und in silico-Methodik zur Aufklärung von Konformationswechseln großer Proteinkomplexe
Online publication date: 16-Dec-2008
Language: german
Abstract: In dieser Dissertation wurden die Methoden Homologiemodellierung und Molekulardynamik genutzt, um die Struktur und das Verhalten von Proteinen in Lösung zu beschreiben. Mit Hilfe der Röntgenkleinwinkelstreuung wurden die mit den Computermethoden erzeugten Vorhersagen verifiziert. Für das alpha-Hämolysin, ein Toxin von Staphylococcus aureus, das eine heptamere Pore formen kann, wurde erstmalig die monomere Struktur des Protein in Lösung beschrieben. Homologiemodellierung auf Basis verwandter Proteine, deren monomere Struktur bekannt war, wurde verwendet, um die monomere Struktur des Toxins vorherzusagen. Flexibilität von Strukturelementen in einer Molekulardynamiksimulation konnte mit der Funktionalität des Proteines korreliert werden: Intrinsische Flexibilität versetzt das Protein in die Lage den Konformationswechsel zur Pore nach Assemblierung zu vollziehen. Röntgenkleinwinkelstreuung bewies die Unterschiede der monomeren Struktur zu den Strukturen der verwandten Proteine und belegt den eigenen Vorschlag zur Struktur. Überdies konnten Arbeiten an einer Mutante, die in einer sogenannten Präporenkonformation arretiert und nicht in der Lage ist eine Pore zu formen, zeigen, dass dieser Übergangszustand mit der Rotationsachse senkrecht zur Membran gelagert ist. Eine geometrische Analyse beweist, dass es sterisch möglich ist ausgehend von dieser Konformation die Konformation der Pore zu erreichen. Eine energetische und kinetische Analyse dieses Konformationswechsels steht noch aus. Ein weiterer Teil der Arbeit befasst sich mit den Konformationswechseln von Hämocyaninen. Diese wurden experimentell mittels Röntgenkleinwinkelstreuung verfolgt. Konformationswechsel im Zusammenhang mit der Oxygenierung konnten für die 24meren Hämocyanine von Eurypelma californicum und Pandinus imperator beschrieben werden. Für eine Reihe von Hämocyaninen ist nachgewiesen, dass sie unter Einfluss des Agenz SDS Tyrosinaseaktivität entfalten können. Der Konformationswechsel der Hämocyanine von E. californicum und P. imperator bei der Aktivierung zur Tyrosinase mittels SDS wurde experimentell bestätigt und die Stellung der Dodekamere der Hämocyanine als wesentlich bei der Aktivierung festgestellt. Im Zusammenhang mit anderen Arbeiten gilt damit die Relaxierung der Struktur unter SDS-Einfluss und der sterische Einfluss auf die verbindenden Untereinheiten b & c als wahrscheinliche Ursache für die Aktivierung zur Tyrosinase. Eigene Software zum sogenannten rigid body-Modellierung auf der Basis von Röntgenkleinwinkelstreudaten wurde erstellt, um die Streudaten des hexameren Hämocyanins von Palinurus elephas und Palinurus argus unter Einfluss der Effektoren Urat und Koffein strukturell zu interpretieren. Die Software ist die erste Implementierung eines Monte Carlo-Algorithmus zum rigid body-Modelling. Sie beherrscht zwei Varianten des Algorithmus: In Verbindung mit simulated annealing können wahrscheinliche Konformationen ausgefiltert werden und in einer anschließenden systematischen Analyse kann eine Konformation geometrisch beschrieben werden. Andererseits ist ein weiterer, reiner Monte Carlo-Algorithmus in der Lage die Konformation als Dichteverteilung zu beschreiben.
In this work homology modeling and molecular dynamics simulations were used to describe the structure and behavior of protein complexes in solution. With the aid of small angle scattering such computer generated models were verified. The monomeric alpha-hemolysin, a toxin from Staphylococcus aureus, which forms heptameric pores, was described for the first time. Homologymodeling based on structural homologues, for which the monomeric structures were known, was used to predict the monomeric structure of the alpha-hemolysin. Flexibility of structural elements could be shown by means of molecular dynamics simulations and correlated to functionality: Intrinsic flexibility enables the protein to undergo the conformational change towards the pore state after assembly onto a membrane. Small Angle X-ray Scattering (SAXS) proved differences to the structure of the homologues proteins and verified the own model. In addition work on a mutant, which is arrested in the so-called pre-pore state and cannot form the pore structure, could provide evidence that the axis of symmetry of the pre-pore complex is perpendicular to the membrane plane. Geometric analysis proves the steric possibility to reach the pore conformation from this pre-pore complex without loosing integrity of the complex. Further analysis with regard to energy and kinetics of this conformational change is pending. A second part of this work considers the conformational changes of hemocyanins. These changes were followed using SAXS as well. Conformational changes as a consequence of oxygenation could be described for the 24mers of Eurypelma californicum and Pandinus imperator. For some hemocyanins it has been shown that the addition of SDS can trigger tyrosinase activity. The conformational change for the hemocyanins E. californicum and P. imperator upon the addition of SDS has been shown experimentally and could be connected to the relative position of the 12meric half-molecules. In connection with other work the steric influence on the subunits b & c is to be considered the most likely cause for the enzymatic activity. An own software for rigid body-modeling on the basis of small angle scattering data was developed to analyze the SAXS data of the hemocyanins from Palinurus elephas and Palinurus argus in presence of ligands such as urate and coffein. This software is the first implementation of a Monte Carlo algorithm for rigid body-modeling. It provides two different approaches: In connection with simulated annealing a likely conformation can be selected and a subsequent systematic screen is able to describe a particular conformation. In addition a different Monte Carlo algorithm is able to describe a conformation as a distribution of sub-conformation in a likelyhood space.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3223
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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