Authors:	Kölsch, Anne Christine
Title:	Untersuchungen des Keratinfilament-Turnovers in lebenden Zellen
Online publication date:	22-Dec-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Das Zytoskelett eukaryotischer Zellen besteht aus drei verschiedenen Protein-Netzwerken: den Aktinfilamenten, Mikrotubuli und Intermediärfilamenten. Intermediärfilamente wurden ursprünglich als statische Strukturen angesehen, die die mechanische Stabilisierung der Zellen übernehmen. In den letzten Jahren hat sich dieses Bild jedoch geändert: Intermediärfilament-Netzwerke sind hochdynamisch und unterliegen kontinuierlichen Veränderungen, welche durch Phosphorylierungen reguliert werden. Sie interagieren mit anderen Zytoskelett-Proteinen und greifen in die Regulation von Schlüsselsignalwegen, die Zellwachstum und Zellteilung sowie Apoptose und Stressantwort bestimmen, ein. Die Mechanismen der Filamentplastizität konnten bisher jedoch nicht vollständig aufgeklärt werden. So ist beispielsweise unklar, wo Auf- und Abbau der Filamente stattfindet und welche Faktoren an der Netzwerkmodulation beteiligt sind. Ziel meiner Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung dieser Mechanismen am Beispiel der epithelialen Keratin-Intermediärfilamente zu leisten. Mit Hilfe von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen von fluoreszenzmarkierten Zellklonen wurden Nukleationszentren in der Zellperipherie identifiziert, in denen Keratinfilamentvorläufer gebildet werden. Es handelt sich dabei um fokale Adhäsionskomplexe, die als Anheftungsstellen zwischen der extrazellulären Matrix und dem intrazellulären Aktinfilament-System dienen. Es konnte gezeigt werden, dass diese Filamentvorläufer-Entstehung für alle untersuchten Keratinisoformen gültig ist und in epitelialen als auch nicht-epithelialen Zelltypen abläuft. Knock-Down der Adhäsionskomponente Talin verhinderte die Keratinfilamentbildung. Modulation der fokalen Adhäsionskinase, die den Auf- und Abbau der Adhäsionskomplexe koordiniert, beeinflusste ebenso die Bildung der Keratinfilamentnetzwerke. Es konnte weiterhin beobachtet werden, dass die N-terminalen Isoformen IE und IF des Zytolinkers Plectin in fokalen Adhäsionen lokalisieren und damit möglicherweise an der Vernetzung von Keratinfilamentvorläufern, Zelladhäsionen und Aktinfilamenten beteiligt sind. Letztlich stellte sich heraus, dass die Bildung der Keratinfilamentvorläufer unabhängig von Proteintranslation ist. In den mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen wurde im Anschluss an die Keratinfilamentbildung ein kontinuierlicher zentripetaler Transport der wachsenden Vorläuferpartikel beobachtet. An Hand von pharmakologischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass dieser Transport Aktinfilament-abhängig ist. Zeitgleich kommt es zu Partikelfusion und Integration in das periphere Netzwerk, das sich weiterhin in Richtung auf das Zellzentrum bewegt. Mit Hilfe von Photoaktivierungsversuchen und Zellfusionsexperimenten konnte die Hypothese bestätigt werden, dass der Abbau der einwandernden Keratinfilamente in lösliche, rasch diffusible Zwischenstufen den kontinuierlichen peripheren Neuaufbau ermöglicht. Aus den Beobachtungen und bereits bekannten Ergebnissen wurde ein Modell des Keratin-Zyklus entwickelt, das die folgenden Stadien umfasst: Nukleation von Keratinfilamentvorläufern an fokalen Adhäsionen in der Zellperipherie, Elongation und Fusion der Keratinfilamentvorläufer bei zeitgleichem Aktinfilament-abhängigem zentripetalen Transport, Integration der Keratinfilamentvorläufer in das periphere Netzwerk, Bündelung der Filamente, Filamentabbau in lösliche Untereinheiten und Neubeginn des Zyklus in der Zellperipherie. Eine Störung dieses Zyklus liegt bei mutierten Keratinen vor, welche die Ursache von Blasen-bildenden Hauterkrankungen sind. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel von Keratin 6a-Mutanten, welche die Hauterkrankung Pachyonychia congenita verursachen, gezeigt, dass bei diesen Keratinen die Nukleation zwar im Bereich der Adhäsionskomplexe regelrecht abläuft, die anschließende Elongation und Netzwerkbildung aber gestört ist, so dass statt dessen kurzlebige, hyperphosphorylierte Granula entstehen. Der resultierende frustrane Keratin-Zyklus in der Zellperipherie ist stark beschleunigt und kann durch p38-Inhibierung gestoppt werden. Bei Proteasomeninhibierung wird der Zyklus in Richtung der Granulabildung verschoben. In dieser Arbeit wird erstmals das Keratin-Tretmühlen-Modell vorgestellt, das den regulierbaren Auf- und Abbau-Zyklus des Keratinnetzwerks beschreibt. Damit liegen testbare Hypothesen für die Aufklärung der Keratinfilament-Plastizität in physiologischen und pathologischen Situationen vor, die nach unseren ersten Ergebnissen auch von Relevanz für andere Intermediärfilamenttypen sind. The cytoskeleton of eukaryotic cells consists of three different networks that are composed of actin filaments, microtubules and intermediate filaments. Initially, the intermediate filaments were seen as rather static structures that are responsible for mechanical stability of the cell. In recent years, however, this notion has changed. Intermediate filament networks are highly dynamic and are subject to continuous change regulated by phosphorylation. They interact with other cytoskeletal proteins and influence the regulation of key signalling pathways that determine cell growth and division as well as apoptosis and stress response. The underlying molecular mechanisms and determinants of filament plasticity, though, are only poorly understood. E.g., it is still unclear where assembly and disassembly take place and what factors are involved in the regulation of network modulation. The aim of my thesis was to make a contribution to the clarification of these mechanisms by examining the epithelial keratin intermediate filaments in living cells. Time-lapse recordings of cell clones that were engineered to produce fluorescent keratins helped to identify focal adhesion sites in the cell periphery as nucleation sites where keratin filament precursors emerged. I could show that focal-adhesion related filament precursor formation occurs independent of keratin isoform and cell-type, including even non-epithelial cells. Furthermore, knock-down of the adhesion component talin inhibited keratin filament precursor formation. Modulation of focal adhesion kinase, which coordinates the assembly and the disassembly of adhesion complexes, also influenced the formation of the keratin filament precurors. In addition, it was observed that the N-terminal isoforms IE and IF of the cytolinker protein plectin localise in focal adhesions and might therefore play a role in linking keratin filament precursors to adhesion complexes and actin filaments. Finally, by using inhibitors of protein translation I could demonstrate that keratin filament precursor formation is independent of protein biosynthesis. In microscopic time-lapse recordings a continuous centripetal transport of growing precursor particles was observed after nucleation. In pharmacological experiments it was shown that this transport depends on intact actin filaments. During transport, particles fuse and finally integrate into the peripheral network, which continues to translocate toward the cell centre. Photoactivation and cell fusion experiments revealed that inward-moving keratin filaments disassemble into solubleand rapidly diffusible subunits that are reutilized for another cycle of peripheral assembly. From these observations and other results a model of the keratin cycle was developed that includes the following steps: nucleation of keratin filament precursors in the vicinity of focal adhesions in the cell periphery, elongation and fusion of keratin filament precursors which are simultaneously moved toward the cell centre by an actin filament-dependent transport, integration of keratin filament precursors into the peripheral network, bundling of keratin filaments, disassembly into soluble sub-units and initiation of the another assembly cycle in the cell periphery. A disruption of the cycle is apparent in mutated keratins, which cause various skin diseases. I could show by using of keratin 6a mutants, which cause the skin disease Pachyonychia congenita, that the mutation does not interfere with nucleation near adhesion complexes and actin-dependent transport. The subsequent filament elongation and network formation phases, however, are disturbed leading to appearance of short-lived, hyperphosphorylated granules. The resulting keratin cycle is therefore accelerated. It can be stopped by p38 inhibitors and mutant keratin disassembly can be inhibited by proteasome inhibitors. This thesis introduced a novel model of the keratin cycle that is termed the "keratin treadmill" and describes the adjustable assembly- and disassembly-cycle of the keratin network. It thereby provides testable hypotheses for the elucidation of keratin filament plasticity in physiological and pathological situations with potential relevance for other intermediate filament types.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3221
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-18247
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen