Authors:	Pfannebecker, Jens
Title:	Entwicklung und Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Art- und Stamm-Identifizierung pro- und eukaryotischer Organismen
Online publication date:	10-Dec-2008
Year of first publication:	2008
Language:	german
Abstract:	Das Wachstum von Milchsäurebakterien-Arten der Gattungen Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc während der Weinfermentation kann durch die Bildung verschiedener Stoffwechselprodukte zu Weinfehlern führen. Um rechtzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen zu können und einem Weinverderb vorzubeugen, bedarf es geeigneter Identifizierungsmethoden. Klassische mikrobiologische Methoden reichen oft nicht aus, um Mikroorganismen auf Art- und Stammniveau gezielt zu identifizieren. Wegen ihrer schnellen Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit sind molekularbiologische Identifizierungsmethoden zur Kontrolle der mikrobiellen Flora während der Lebensmittelfermentierung in der heutigen Zeit unabdingbar. In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden die 23S rRNA-Gensequenzen von neun Pediococcus-Typstämmen sequenziert, analysiert und phylogenetische Analysen durchgeführt. Zur Art-Identifizierung der Pediokokken wurden PCR-Primer generiert und ein Multiplex PCR System entwickelt, mit dem alle typischen Arten simultan in einer Reaktion nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse der Multiplex PCR-Identifizierung von 62 Pediococcus-Stämmen aus Kulturensammlungen und 47 neu isolierten Stämmen aus Wein zeigten, dass einige Stämme unter falschen Artnamen hinterlegt waren, und dass P. parvulus im Weinanbaugebiet Rheinhessen weit verbreitet war. Die Fähigkeit der Pediococcus-Stämme zur Exopolysaccharid-Synthese wurde durch den Nachweis zweier Gene überprüft. Auf Basis der 23S rDNA-Sequenzen wurden rRNA-Sekundärstrukturen mit der neu entwickelten Software Structure Star generiert, die zum Auffinden von Zielbereichen für fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden geeignet waren. Die Sequenzunterschiede zwischen den Pediococcus-Arten reichten aus, um zwei Gruppen durch Fluoreszenz in situ Hybridisierung differenzieren zu können. Die Verwendung unmarkierter Helfer-sonden verbesserte die Zugänglichkeit der Sonden an die rRNA, wodurch das Fluoreszenz-Signal verstärkt wurde. Um Milchsäurebakterien durch Denaturierende Gradienten Gel Elektrophorese differenzieren zu können, wurden Primer entwickelt, mit denen ein hochvariabler 23S rDNA-Bereich amplifiziert werden konnte. Die Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR wurde in der vorliegenden Arbeit zur Art- und Stamm-Differenzierung pro- und eukaryotischer Organismen angewandt. Es wurden vor allem weinrelevante Milchsäurebakterien der Gattungen Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus und Leuconostoc und Hefen der Gattungen Dekkera / Brettanomyces und Saccharomyces untersucht. Die Cluster-Analyse der Pediococcus-Typstämme führte zu einer unterschiedlichen Baum-Topologie im Vergleich zum phylogenetischen 23S rDNA-Stammbaum. Die Verwandtschaftsverhältnisse der untersuchten O. oeni-Stämme aus Starterkulturen konnten in Bezug auf eine frühere Cluster-Analyse reproduziert werden. Die Untersuchung von 40 B. bruxellensis-Stämmen aus rheinhessischen Weinproben zeigte eine Gruppierung der Stämme gemäß dem Ort der Probennahme. Beim Vergleich der Verwandtschaftsverhältnisse von Stämmen der Arten P. parvulus und B. bruxellensis, die aus denselben Weinproben isoliert wurden, konnte eine hohe Übereinstimmung der beiden Baum-Topologien beobachtet werden. Anhand der SAPD-PCR Untersuchung von Sekthefen aus Starterkulturen konnten alle Stämme der Art S. cerevisiae zugeordnet werden. Die nSAPD-PCR war darüber hinaus geeignet, um höhere Eukaryoten wie Weinreben zu differenzieren und es konnten die Verwandtschaftsverhältnisse von Mäusen und menschlichen Individuen durch Cluster-Analysen nachvollzogen werden. Mit Hilfe der Sequence Characterized Amplified Region (SCAR)-Technik wurden (n)SAPD-Marker in SCAR-Marker konvertiert. Die neu generierten SCAR-Primer konnten zur simultanen Art-Identifizierung von sieben weinschädlichen Milchsäurebakterien in einer Multiplex PCR erfolgreich eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit entwickelten molekularbiologischen Identifizierungsmethoden können zum Beispiel in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle Anwendung finden. The growth of lactic acid bacteria of the genera Lactobacillus, Pediococcus and Leuconostoc during wine-fermentation can lead to wine faults due to the formation of different metabolic compounds. In order to take up countermeasures to prevent wine spoilage, suitable identification methods are required. Classical microbiological methods often do not suffice to identify microorganisms on species and strain level. Due to their fast feasibility and reliability, molecular biological identification methods for control of the microbial flora are indispensable during the fermentation of foods and beverages nowadays. In the present study, the 23S rRNA gene sequences of nine Pediococcus type strains were sequenced, analysed and phylogenetic analyses were carried out. For species identification of the pediococci, PCR primers were generated and a multiplex PCR assay was developed to identify all typical species simultaneously in a single reaction. The results of multiplex PCR identification of 62 Pediococcus strains from culture collections and 47 recently isolated strains from wine showed that some strains were deposited under wrong species names and that P. parvulus was spread out far into the wine culturing area of Rhine-Hesse (Rhineland-Palatinate, Germany). The ability of the Pediococcus strains for exopolysaccharide synthesis was checked by the analysis of two genes. Based on the 23S rDNA sequences, rRNA secondary structures which were apt to find targets for fluorescence labelled DNA probes, were generated with the newly developed software Structure Star. The sequence differences between the Pediococcus species were sufficient to differentiate two groups by Fluorescence in situ Hybridization. The use of unlabelled helper probes improved the probe-accessibility to the rRNA through which the fluorescence signal was amplified. To be able to differentiate lactic acid bacteria by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, primers were developed that could amplify a highly variable 23S rDNA region. The Nested Specifically Amplified Polymorphic DNA (nSAPD)-PCR was used for the differentiation of species and strains of pro- and eukaryotic organisms. Primarily, wine relevant lactic acid bacteria of the genera Oenococcus, Lactobacillus, Pediococcus and Leuconostoc and yeasts of the genera Dekkera / Brettanomyces and Saccharomyces were examined. The cluster analysis of the Pediococcus type strains showed a different tree topology compared to the 23S rDNA phylogenetic tree. The relationship of the examined O. oeni strains from starter cultures could be proven with respect to an earlier cluster analysis. The examination of 40 B. bruxellensis strains from the wine-growing region Rhine-Hesse showed a grouping according to the origin where the samples were taken. When comparing the relationships of strains of the species P. parvulus and B. bruxellensis which were isolated from the same wine samples a significant compatibility of the two tree topologies could be examined. With the SAPD-PCR examination of champagne yeasts from starter cultures all strains could be assigned to the species S. cerevisiae. Furthermore, the nested SAPD-PCR was apt to differentiate higher eukaryotes like grapevine cultivars and the relationship conditions of mice and human individuals could be displayed through cluster analysis. With help of the Sequence Characterized Amplified Region (SCAR) technique, SAPD markers were converted in SCAR markers. The newly generated SCAR primers could be used successfully for the simultaneous species identification of seven wine spoilage lactic acid bacteria in a multiplex PCR approach. The molecular biological identification methods developed in this work can be applied in the microbiological quality control for example.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3220
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-18238
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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