Authors:	Seppmann, Torsten
Title:	Antigen-dependent induction of a CD40 signal in peripheral B cells
Online publication date:	7-Sep-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Monoclonal antibodies have emerged as one of the most promising therapeutics in oncology over the last decades. The generation of fully human tumorantigen-specific antibodies suitable for anti-tumor therapy is laborious and difficult to achieve. Autoreactive B cells expressing those antibodies are detectable in cancer patients and represent a suitable source for human antibodies. However, the isolation and cultivation of this cell type is challenging. A novel method was established to identify antigen-specific B cells. The method is based on the conversion of the antigen independent CD40 signal into an antigen-specific one. For that, the artificial fusion proteins ABCos1 and ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) were generated, which consist of an extracellular association-domain derived from the constant region of the human immunoglobulin (Ig) G1, a transmembrane fragment and an intracellular signal transducer domain derived of the cytoplasmic domain of the human CD40 receptor. By the association with endogenous Ig molecules the heterodimeric complex allows the antigen-specific stimulation of both the BCR and CD40. In this work the ability of the ABCos constructs to associate with endogenous IgG molecules was shown. Moreover, crosslinking of ABCos stimulates the activation of NF-κB in HEK293-lucNifty and induces proliferation in B cells. The stimulation of ABCos in transfected B cells results in an activation pattern different from that induced by the conventional CD40 signal. ABCos activated B cells show a mainly IgG isotype specific activation of memory B cells and are characterized by high proliferation and the differentiation into plasma cells. To validate the approach a model system was conducted: B cells were transfected with IVT-RNA encoding for anti-Plac1 B cell receptor (antigen-specific BCR), ABCos or both. The stimulation with the BCR specific Plac1 peptide induces proliferation only in the cotransfected B cell population. Moreover, we tested the method in human IgG+ memory B cells from CMV infected blood donors, in which the stimulation of ABCos transfected B cells with a CMV peptide induces antigen-specific expansion. These findings show that challenging ABCos transfected B cells with a specific antigen results in the activation and expansion of antigen-specific B cells and not only allows the identification but also cultivation of these B cells. The described method will help to identify antigen-specific B cells and can be used to characterize (tumor) autoantigen-specific B cells and allows the generation of fully human antibodies that can be used as diagnostic tool as well as in cancer therapy. Monoklonale Antikörper stellen heute einen beachtlichen Teil des tumortherapeutischen Arsenals dar und haben sich fest in der klinischen Anwendung etabliert. Die Herstellung von humanen Antikörpern für die Behandlung von Tumoren ist äußerst schwierig. B Zellen, welche gegen tumorassoziierte Antigene Antikörper produzieren, stellen eine mögliche Quelle für solche humanen Antikörper dar. Allerdings ist bis heute die Identifizierung und Kultivierung dieser speziellen autoreaktiven B Zellen herausfordernd. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, antigenspezifische B Zellen in einem Gesamtrepertoire an B Zellen zu identifizieren. Die Methode basiert auf der Umwandlung des Antigen-unabhängigen CD40 Signals in ein Antigen-abhängiges. Hierfür wurden die artifiziellen Fusionsproteine ABCos1 und ABCos2 (Antigen-specific B cell co-stimulator) entwickelt, welche eine extrazelluläre Assoziierungsdomäne abgeleitet vom humanen IgG1, eine Transmembrandomäne und eine intrazelluläre CD40 Signalinduktions Domäne besitzen. Durch die Heterodimerisierung mit dem endogenen Immunglobulin entsteht ein artifizieller Rezeptor, welcher die gleichzeitige antigenspezifische Induktion vom B-Zell-Rezeptor (BZR) und CD40 Signal in B Zellen ermöglicht. Die ABCos Konstrukte sind in der Lage, durch Quervernetzung ein NF-κB Signal in HEK293-lucNifty und Proliferation in B Zellen zu induzieren. Die Antikörper-vermittelte Quervernetzung von ABCos führt zu einem phenotypischen Aktivierungsmuster in B Zellen, welches sich vom konventionellen CD40 Signal unterscheidet. Durch die ABCos spezifische Aktivierung werden hauptsächlich IgG+ Gedächtnis B Zellen aktiviert, welche stark proliferieren und zu Plasmazellen differenzieren. Um die Methode zu validieren, wurden Modelsysteme verwendet: Zuerst wurden B Zellen entweder mit einen Plac1 Peptid spezifischen BZR, mit ABCos oder gleichzeitig mit BZR und ABCos transfiziert. Die Stimulierung mit dem BZR spezifischen Plac1 Peptid führt nur in ABCos und BZR doppelt-transfizierten B Zellen zu einer Aktivierung und der Induktion von Proliferation. Darüber hinaus wurde die Methode an humanen IgG+ Gedächtnis B Zellen von CMV infizierten Patienten getestet. Nur IgG+ Gedächtnis B Zellen, die mit ABCos transfiziert wurden, konnten mittels eines CMV spezifischen Peptids zur Proliferation gebracht werden und somit identifiziert werden. Diese Daten zeigen, dass ABCos transfizierte B Zellen durch antigenspezifische Stimulierung aktiviert und expandiert werden können. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung und Kultivierung von antigenspezifischen B Zellen und erlaubt die Charakterisierung von (tumor) autoantigenspezifischen B Zellen. Weiterhin ermöglicht sie die Generierung von voll-humanen Antikörpern, welche für die Diagnostik oder Therapeutik von Interesse sind.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3177
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-28685
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	110 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen