Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3173
Authors: Werner, Sonja
Title: Nachweis und Charakterisierung der Ketocarotinoidakkumulation in Zygosporen des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii
Online publication date: 23-Aug-2011
Language: german
Abstract: Ketocarotinoide sind in den Dauerstadien vieler Grünalgen anzutreffen und aufgrund ihres hohen antioxidativen Potentials vermutlich von großer Bedeutung für deren Überleben unter ungünstigen Umweltbedingungen. Daneben ist die Aufnahme von Ketocarotinoiden im Zuge der Nahrungskette für verschiedene Tiere lebensnotwendig. Trotz zahlreicher Untersuchungen des Biosynthesewegs der Ketocarotinoide, vorwiegend in der Grünalge Haematococcus pluvialis, sind viele grundlegende Aspekte der Synthese nicht verstanden. Dazu zählt neben dem genauen Reaktionsmechanismus des ketolierenden Enzyms ß-Carotin-Ketolase (BKT) vor allem der noch nicht aufgeklärte Zusammenhang zwischen Lipidsynthese und Ketocarotinoidakkumulation. Nach der Entdeckung eines zur BKT aus H. pluvialis homologen Gens in einer EST-Datenbank des Modellorganismus Chlamydomonas reinhardtii wurden im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit die als orange-rot beschrieben Zygosporen von C. reinhardtii als mögliches ketocarotinoidhaltiges Zellstadium untersucht. Dabei wurden für C. reinhardtii erstmals Ketocarotinoide in Konzentrationen bis zu einem Femtomol pro Zelle nachgewiesen und mittels HPLC-Analytik, chemischer Derivatisierung und Massenspektrometrie zweifelsfrei identifiziert. Es wurden, in aufsteigender Quantität, drei Ketocarotinoide detektiert: Canthaxanthin, Astaxanthin und 4-Ketolutein. Letzteres wurde bisher selten in anderen ketocarotinoidakkumulierenden Organismen beschrieben und stellt, im Gegensatz zu den vom ß-Carotin abgeleiteten Pigmenten Astaxanthin und Canthaxanthin, ein Pigment des α-Carotin-Zweiges dar. Astaxanthin und 4-Ketolutein wurden vor allem in Form von Pigment-Fettsäureestern nachgewiesen. Mit Hilfe von Paarungsansätzen mit der lor1-Mutante, die keine α-Carotinoide synthetisieren kann, und Vergleichen mit Ketocarotinoiden aus H. pluvialis konnte gezeigt werden, dass 4 Ketolutein nur als Monoacylester in der Alge vorliegt, während Astaxanthin sowohl als Monoacyl- wie auch als Diacylester anzutreffen ist. Ketocarotinoide wurden innerhalb der ersten 14 Tage der Zygotenreife gebildet. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Zygoten dokumentierten, dass damit ein starker Umbau der Zelle einherging, der sich vor allem in der Reduktion des Chloroplasten und der Bildung von Lipidtröpfchen darstellte. Letztere nahmen bei reifen Zygosporen den größten Teil des Zelllumens ein und wurden mittels dünnschichtchromatografischer Analysen als Neutralfette identifiziert. Der sinkende Zellgehalt an Carotinoiden im Zuge der Zygosporenreifung und Inhibitorexperimente an reifenden Zygoten mittels Norflurazon zeigten, dass für die Ketocarotinoidakkumulation keine Neusynthese von Carotinoiden nötig ist und lassen die Hypothese zu, dass C. reinhardtii die im Zuge der Chloroplastenreduktion freigesetzten Photosynthese-Carotinoide als Substrate für die Ketocarotinoidsynthese verwendet. Physiologische Bedeutung könnte den Ketocarotinoiden vor allem beim Schutz der Speicherlipide vor Peroxidation durch reaktive Sauerstoffspezies zukommen. Diese Reservestoffe stellen die Energieversorgung während des Auskeimens der Zellen sicher. Durch den im Rahmen der vorliegenden Forschungsarbeit dokumentierten Nachweis der Ketocarotinoidakkumulation in C. reinhardtii können die Ketocarotinoidsynthese und vor allem der Zusammenhang von Lipid- und Ketocarotinoidakkumulation zukünftig mit Hilfe der für diesen Modellorganismus vorliegenden umfangreichen molekulargenetischen Methoden detailliert untersucht werden.
The resting stages of many green algae accumulate ketocarotenoids that, due to their high antioxidant potential, are presumably of major importance for the survival of these cells. Additionally, the uptake of ketocarotenoids is important for the reproductive success of aquatic animals such as salmonids. Despite numerous studies on the green alga Haematococcus pluvialis, many fundamental aspects of the biosynthesis of ketocarotenoids are not well understood, such as the details of the reaction catalyzed by the key enzyme ß-carotene-ketolase (BKT) or the correlation between synthesis of lipids and accumulation of ketocarotenoids. Analyses of EST data from Chlamydomonas reinhardtii identified a gene homologous to the BKT gene of H. pluvialis. Here, the orange-red zygospores of C. reinhardtii were investigated for the occurrence of ketocarotenoids, demonstrating the presence of up to one femtomol ketocarotenoids per cell. Using HPLC, chemical derivatization and mass spectrometry, the major ketocarotenoids in the zygospores of C. reinhardtii were identified as canthaxanthin, astaxanthin and 4-ketolutein. In contrast to the ß-carotene-derived pigments astaxanthin and canthaxanthin, 4-ketolutein is derived from α-carotene and so far has been detected only in a few green algae. Astaxanthin and 4-ketolutein were mainly present as acyl esters. Pigment analyses of homozygous zygospores of the C. reinhardtii lor1-mutant which is deficient in the biosynthesis of α-carotenoids lent further support to the pigment identification. Moreover, the results indicated that astaxanthin occurs as mono- and diacyl esters whereas 4-ketolutein gives rise only to monoacyl esters. The ketocarotenoids were found to accumulate during the first two weeks of zygospore maturation. Transmission electron microscopy showed that the ketocarotenoid formation is accompanied by a reorganization of the cells, including a strong reduction in chloroplast size and a massive accumulation of lipid globules. The lipid globules contained mostly neutral lipids as demonstrated by thin-layer chromatographic analyses of lipid extracts from zygospores. The observed overall decrease of carotenoids in the zygospores and experiments with the carotenoid biosynthetic inhibitor norflurazon suggest that the ketocarotenoids are not synthesized de-novo, but are made from the photosynthetic carotenoids released during degradation of the thylakoid membranes. The physiological function of the ketocarotenoids in the zygospores of C. reinhardtii may be to protect the storage lipids from lipid peroxidation by reactive oxygen species. The storage lipids supply the energy necessary for germination of the zygospores. Based on the present study, future investigations on the biosynthesis of ketocarotenoids and the interdependence of lipid and ketocarotenoid accumulation in green algal resting stages will be facilitated by the powerful molecular tools that are available for the model organism C. reinhardtii.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3173
URN: urn:nbn:de:hebis:77-28648
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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