Authors:	Schach, Denise
Title:	Direct electron transfer to cytochrome c oxidase investigated by electrochemistry and time-resolved surface-enhanced infrared absorption spectroscopy
Online publication date:	12-Jul-2011
Year of first publication:	2011
Language:	english
Abstract:	Cytochrom c Oxidase (CcO), der Komplex IV der Atmungskette, ist eine der Häm-Kupfer enthaltenden Oxidasen und hat eine wichtige Funktion im Zellmetabolismus. Das Enzym enthält vier prosthetische Gruppen und befindet sich in der inneren Membran von Mitochondrien und in der Zellmembran einiger aerober Bakterien. Die CcO katalysiert den Elektronentransfer (ET) von Cytochrom c zu O2, wobei die eigentliche Reaktion am binuklearen Zentrum (CuB-Häm a3) erfolgt. Bei der Reduktion von O2 zu zwei H2O werden vier Protonen verbraucht. Zudem werden vier Protonen über die Membran transportiert, wodurch eine elektrochemische Potentialdifferenz dieser Ionen zwischen Matrix und Intermembranphase entsteht. Trotz ihrer Wichtigkeit sind Membranproteine wie die CcO noch wenig untersucht, weshalb auch der Mechanismus der Atmungskette noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Das Ziel dieser Arbeit ist, einen Beitrag zum Verständnis der Funktion der CcO zu leisten. Hierzu wurde die CcO aus Rhodobacter sphaeroides über einen His-Anker, der am C-Terminus der Untereinheit II angebracht wurde, an eine funktionalisierte Metallelektrode in definierter Orientierung gebunden. Der erste Elektronenakzeptor, das CuA, liegt dabei am nächsten zur Metalloberfläche. Dann wurde eine Doppelschicht aus Lipiden insitu zwischen die gebundenen Proteine eingefügt, was zur sog. proteingebundenen Lipid-Doppelschicht Membran (ptBLM) führt. Dabei musste die optimale Oberflächenkonzentration der gebundenen Proteine herausgefunden werden. Elektrochemische Impedanzspektroskopie(EIS), Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR) und zyklische Voltammetrie (CV) wurden angewandt um die Aktivität der CcO als Funktion der Packungsdichte zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit betrifft die Untersuchung des direkten ET zur CcO unter anaeroben Bedingungen. Die Kombination aus zeitaufgelöster oberflächenverstärkter Infrarot-Absorptionsspektroskopie ( tr-SEIRAS) und Elektrochemie hat sich dafür als besonders geeignet erwiesen. In einer ersten Studie wurde der ET mit Hilfe von fast scan CV untersucht, wobei CVs von nicht-aktivierter sowie aktivierter CcO mit verschiedenen Vorschubgeschwindigkeiten gemessen wurden. Die aktivierte Form wurde nach dem katalytischen Umsatz des Proteins in Anwesenheit von O2 erhalten. Ein vier-ET-modell wurde entwickelt um die CVs zu analysieren. Die Methode erlaubt zwischen dem Mechanismus des sequentiellen und des unabhängigen ET zu den vier Zentren CuA, Häm a, Häm a3 und CuB zu unterscheiden. Zudem lassen sich die Standardredoxpotentiale und die kinetischen Koeffizienten des ET bestimmen. In einer zweiten Studie wurde tr-SEIRAS im step scan Modus angewandt. Dafür wurden Rechteckpulse an die CcO angelegt und SEIRAS im ART-Modus verwendet um Spektren bei definierten Zeitscheiben aufzunehmen. Aus diesen Spektren wurden einzelne Banden isoliert, die Veränderungen von Vibrationsmoden der Aminosäuren und Peptidgruppen in Abhängigkeit des Redoxzustands der Zentren zeigen. Aufgrund von Zuordnungen aus der Literatur, die durch potentiometrische Titration der CcO ermittelt wurden, konnten die Banden versuchsweise den Redoxzentren zugeordnet werden. Die Bandenflächen gegen die Zeit aufgetragen geben dann die Redox-Kinetik der Zentren wieder und wurden wiederum mit dem vier-ET-Modell ausgewertet. Die Ergebnisse beider Studien erlauben die Schlussfolgerung, dass der ET zur CcO in einer ptBLM mit größter Wahrscheinlichkeit dem sequentiellen Mechanismus folgt, was dem natürlichen ET von Cytochrom c zur CcO entspricht. Cytochrome c Oxidase (CcO), which is complex IV of the respiratory chain is a member of the superfamily of heme-copper containing terminal oxidases, and plays a crucial role in the metabolism of cells. The protein complex contains four prosthetic groups and is located in the inner membrane of mitochondria and the cell membrane of many aerobic bacteria. It catalyzes the transfer of electrons from cytochrome c to molecular oxygen, being available for the intrinsic reaction that takes place in the CuB-heme a3 binuclear center. A consumption of four protons to form two water molecules per oxygen molecule(O2) is connected to an electrogenic translocation (pumping) of four protons per reaction cycle across the membrane, thus generating a difference in electrochemical potential of protons between matrix and intermembrane space. Despite their significance membrane proteins, such as CcO are still not much investigated. As a result the mechanism of the respiratory chain is not yet fully understood. It is the aim of this thesis to extend the fundamental understanding of the functionality of CcO. Therefore, CcO from Rhodobacter sphaeroides was tethered to the functionalized metal electrode in a strict orientation, by means of a his-tag engineered to the C-terminus of subunit II. The first electron acceptor is directed towards the metal surface. A lipid bilayer was then reconstituted in-situ around the bound proteins, forming a protein-tethered bilayer lipid membrane (ptBLM). For this purpose the ideal mixing ratio of linking and spacing molecules had to be found. Electrochemical impedance spectroscopy (EIS), surface plasmons resonance spectroscopy (SPR) as well as cyclic voltammetry (CV) were applied to characterize the activity of CcO as a function of the packing density. Another aim of the thesis is to investigate direct electron transfer to CcO. The combination of time-resolved surface-enhanced infrared-absorption spectroscopy (tr- SEIRAS) and electrochemistry has shown to be valuable in this context. Direct electron transfer was therefore investigated using fast scan cyclic voltammetry. Cyclic voltammograms were measured at different scan rates with CcO in the non-activated and the activated state. The activated state was obtained after catalytic turnover of the protein in presence of oxygen. A four-electron transfer model was then designed to analyze the cyclic voltammograms. This method enables us to discriminate between the mechanism of sequential and independent electron transfer to the four redox centers CuA, heme a, heme a3 and CuB. Furthermore, values such as redox potentials and kinetic coefficients of electron transfer could be obtained. Based on these results we can conclude, that direct electron transfer to CcO most likely follows the sequential mechanism thus mimicking the electron transfer from cytochrome c, the genuine electron donor of CcO. On the basis of these results we utilized tr-SEIRAS in the step scan mode to extend the scope of the investigation into the time domain. For this purpose, periodic potential pulses were applied to CcO. SEIRAS in the ATR mode was used to obtain spectra within defined time slides. It was the aim of this project to gain information about vibrational modes of amino acids and peptide groups in conjunction with redox transitions. Bands were tentatively assigned to the redox centers on the basis of data obtained by potentiometric titrations of CcO. Band areas, indicating the redox kinetics of the centers were then plotted against time. Four-ET model was again fitted to the data to obtain the specific standard redox potentials and kinetic coefficients. The results of both studies give strong evidence for the sequential electron transfer that is natural to the enzyme.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3140
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-28267
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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