Authors:	Falter, Tanja
Title:	Untersuchungen über ADAMTS13 in Gerinnungsfaktorpräparaten
Online publication date:	6-Jul-2011
Year of first publication:	2011
Language:	german
Abstract:	Zusammenfassung rnIn der vorliegenden Arbeit wurden sechs VWF/FVIII Gerinnungsfaktorkonzentrate unterschiedlicher Chargen auf ihre ADAMTS13 Aktivität, Antigen und VWF Multimere untersucht. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Aufkonzentrierung des VWFs möglicherweise auch erhöhte Mengen an ADAMTS13 vorhanden sind. Wäre dies nachweisbar, könnten die entsprechenden Konzentrate auch Anwendung bei TTP Patienten finden. Neben den Gerinnungsfaktorkonzentraten wurden ebenfalls die zur Plasmapherese verwendeten Therapeutika FFP und s/d Plasma analysiert. Es soll getestet werden, ob Unterschiede hinsichtlich der Qualität zwischen den Präparaten bestehen und inwiefern die Blutgruppen eine Auswirkung auf die ADAMTS13 Aktivität/Antigen haben. Überdies wurde die Bedeutung von ADAMTS13 als wichtiges diagnostisches Merkmal im Rahmen der Gegenüberstellung von Patienten mit thrombotischen Mikroangiopathien erörtert. Alle angewandten Methoden wurden zudem kritisch miteinander verglichen und auf ihre Eignung für die klinische Diagnostik getestet. Zur Untersuchung der ADAMTS13 Aktivität kamen drei unterschiedliche Methoden zur Anwendung, die BCS-Methode nach Böhm und zwei FRET Kits ( Technozym®ADAMTS13/ActifluorTMADAMTS13). Für die Bestimmung des ADAMTS13 Antigen wurde das Technozym®ADAMTS13 Kit verwendete als auch der Imubind®ELISA angewendet. Mittels der SDS-Gelelektrophorese konnten die VWF Multimere dargestellt werden. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass nur in Haemate®P, deutlich höhere ADAMTS13 Aktivitäten (12,3% bzw. 470ng/ml) sowie ein physiologische Antigenwerte vorlagen. Die anderen Faktorkonzentrate wiesen entweder nur sehr geringe bzw. keine Aktivitäten auf. Das Antigen lag bei allen Konzentraten im nachweisbaren Bereich. Folglich ist ein Einsatz von Haemate®P bei der Therapie der TTP, insbesondere bei hereditären Formen sowie bei Kindern, die durch eine Plasmapherese stark belastet werden, und bei Schwangeren, könnten, in Erwägung zu ziehen und innerhalb der Klinik zu testen. Die Plasmapräparate FFP und Octaplas® wiesen in allen Untersuchungen ADAMTS13 Aktivitäten und Antigen im mittleren bis hohen physiologischen Bereich auf. Insbesondere bei Blutgruppe 0 ließ sich beiden Präparaten eine höhere ADAMTS13 Aktivität und Antigen gegenüber den drei anderen Blutgruppen darstellen. Insgesamt waren die interindividuellen Schwankungen bei FFP deutlich höher als bei Octaplas®, was sich in der unterschiedlichen Herstellung der Präparate begründen lässt. Octaplas® ist also genauso geeignet zur Plasmapherese bei der TTP wie FFP, kann jedoch aufgrund seiner intensiveren Virusinaktivierung eine größere Sicherheit aufweisen und stellt sich auch in der Klinik als nebenwirkungsärmer dar. Bei der Gegenüberstellung der thrombotischen Mikroangiopathien konnte gezeigt werden, dass eine verminderte ADAMTS13 Aktivität ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal ist und auch während der Remission schon diagnostizierbar werden kann. Auf der Grundlage der labordiagnostischen Werte und dem klinischen Erscheinungsbild im akuten Schub und in der Remission konnte ein diagnostischer Algorithmus für den klinischen Alltag erstellt werden. In der Methodenvalidierung erwies sich der ActifluorTMADAMTS13 Kit als der beste Kit, da er innerhalb kürzester Zeit zuverlässige Werte in Standardeinheiten liefert. Nach neuesten Erkenntnissen, bei der eine Unterscheidung von ADAMTS13 Aktivitäten über und unter 5 % von großer prognostischer Bedeutung sind, ist die BCS-Methode nach Böhm mit einer unteren Nachweisgrenze von 6,2% zu ungenau und auch hinsichtlich ihres Zeitaufwandes eher ungünstig.rn Summary rnIn 1996 Furlan et al. and Tsai discovered both coincidentally the protease ADAMTS13 during their studies on the disease of TTP. A low activity or the total absence of this protein is the cause of TTP. Whereas slightly low activity of ADAMTS13 is discussed to be the reason of juvenile strokes and cardiovascular incidences. We investigated ADAMTS13 acitivity, antigen and VWF multimere in six VWF/FVIII blood clotting factors concentrates. The underlying hypothesis states that the manufacturing process of VWF concentrates also increases ADAMTS13. We also investigated FFP and s/d plasma. Additionally this testing can show differences in quality of the compounds as well as the impact of different blood types on ADAMTS13 activity and antigen. ADAMTS13 was tested as a diagnostic sign for patients with thrombotic microangiopathies. Due to this an algorithm was found for patients who suffer HUS; TTP-like syndromes and TTP with and without antibodies. All methods for measurements are proved on critically as well as the comparison to each other and the suitability for diagnostics in everyday life. For ADAMTS13 activity measurement BCS-Method according to Boehm two fluorescence resonance energy transfer methods (Technozym®ADAMTS13 / ActiflourTMADAMTS13) were used. ADAMTS13 antigen was detected with Technozym®ADAMT13 and Imubind®ELISA. By using SDS gel electrophoresis VWF multimers were detected. The research proved that only Haemate®P has a higher activity of ADAMST13 (12,3% / 470ng/ml) and it also has an physiologic antigen. In the other factor concentrates only the antigen could be detected. Using the gel electrophoresis one could find the typical triplet structure of VWF and UL VWF multimers. There was no prove of ADAMTS13 antibodies. Haemate®P is the only concentrate which can probably be tested in the diagnostics and therapy of TTP. Haemate®P could be used for children, who suffer under the procedure of plasmapheresis or during pregnancy. FFP and Octaplas® showed in all examinations ADAMTS13 activity in an average to high amount. Octaplas® was slightly higher. FFP was able to be measured three very low mean values out of four blood types. Also a difference within blood types concerning the activity of ADAMS13 and its antigen could be found. Especially type 0 shows a higher activity and more antigens than the other blood types. The fluctuations between individuals by using FFB were higher than with Octaplas®. The reason can be explain in the manufacturing process of making the preparations. UL VWF multimers could be found in every sample and in different concentrations. Octaplas® is as suitable for the treatment of TTP as FFP. It stands out by less side effects and lower risks of viruses transmitted diseases. ADAMTS13 is an important distinguishing feature for the diagnosis of thrombotic microangopathies. Based on the diagnostic parameters and clinical features an algorithm could be established in which ADAMTS13 activity and UL VWF multimers are the key issue. Little time consumption and standard units waited Actifluor®ADAMTS13 as the best assay for laboratory work. According to recent findings the BCS-Method becomes too imprecise when the ADAMTS13 activity differs more than 5 %. The detection limit is 6.2 %, which is very poor and it takes too much time.rnrn
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3131
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-28161
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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