Authors:	Gather, Fabian Matthias
Title:	Analyse der Expression der humanen induzierbaren NO-Synthase (iNOS) : Einfluss der 5’-UTR auf die Expression der humanen iNOS und Expression der humanen iNOS in Modellen der neuronalen Differenzierung
Online publication date:	27-Feb-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Nach Induktion der Expression der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) durch Cytokine produziert das Enzym hohe Mengen an NO, die vorteilhafte mikrobizide, antiparasitale, antivirale und antitumorale Wirkungen haben können. Im Gegensatz dazu scheint die aberrante iNOS-Induktion Teil der Pathologie des septischen Schocks und vieler Autoimmunerkrankungen zu sein. Eine feinregulierte Kontrolle der Expression der iNOS ist daher für ihre Funktion in vielen Prozessen im menschlichen Körper unabdingbar. Das Auftreten eines für humane Zellen spezifischen offenen Leserasters (upstream open reading frame, uORF) in der 5'-untranslatierten Region (5'-UTR) impliziert eine translatorische Regulation der iNOS-Expression und könnte ein evolutionärer Vorteil sein, der eine zusätzliche Ebene der iNOS-Regulation eröffnen könnte. Transfektionsexperimente mit Reportergen-Plasmiden in humanen DLD1-Zellen ergaben, dass der uORF trotz seiner Translatierbarkeit den Translationsstart am eigentlichen iNOS-Startcodon nicht zu hemmen scheint. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten zeigen deutlich, dass die humane iNOS-Translation cap-abhängig ist und dass die 5'-UTR der iNOS-mRNA keine interne Ribosomen-Eintrittsstelle enthält. Die Translation der iNOS-Kodierungssequenz wird höchstwahrscheinlich durch einen leaky scanning-Mechanismus vermittelt, der durch die schwache Kozak-Sequenz des uORF im Vergleich zur eigentlichen iNOS-Kozak-Sequenz erklärt werden kann. Das uORF-Stopcodon befindet sich vor dem ersten Intron, was auf eine Beteiligung des Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) an der iNOS-Regulation hindeutet. Eine Herunterregulierung von UPF1 durch siRNA führte zu einer verstärkten endogenen Cytokin-induzierten iNOS-Expression in humanen DLD1-Zellen und einer höheren mRNA-Stabilität. Die Transfektion von Konstrukten, die iNOS-Exon 1, -Intron 1 und -Exon 2 vor einem Luciferase-Gen enthalten, zeigte einen deutlichen Effekt der Mutation des uORF-Startcodons auf die Luciferase-Reportergen-Expression. Damit konnte gezeigt werden, dass der uORF die Intensität der iNOS-Expression und ihre Dauer über den NMD-Mechanismus verringert. Neben der Wirkung der iNOS im Immunsystem scheint sie auch eine wichtige Rolle bei der neuronalen Entwicklung zu spielen. Hohe NO-Mengen, aber auch eine fehlerhafte iNOS-Expression oder NO-Produktion führen zu aberrativer Entwicklung und teratogenen Effekten. Datenbank- und qRT-PCR-Analysen zeigten eine Hochregulation der humanen iNOS-mRNA-Expression während der Differenzierung von hiPSC oder hESC zu Neuronen. Die 5'-RACE-Analyse zeigte, dass die in den differenzierenden hiPSC exprimierte iNOS-mRNA anstelle der ersten beiden Exons des regulären iNOS-Transkripts ein alternatives neuronenspezifisches Exon 1 enthält. Damit wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neues iNOS-Transkript und eine neue Isoform ermittelt, die in den ersten Stadien der neuronalen Entwicklung exprimiert wird und eine mögliche Zielstruktur für neue Therapien, zum Beispiel neurodegenerativer Erkrankungen, bieten kann. After induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression by cytokines, the enzyme produces high amounts of NO, which can have beneficial microbicidal, antiparasital, antiviral and antitumoral effects. In contrast, aberrant iNOS induction seems to be part of the pathology of septic shock and many autoimmune diseases. Thus, a fine-regulated control of the expression of the iNOS is essential for the function of many processes in the human body. The discovery of a human specific upstream open reading frame (uORF) in the 5’-untranslated region (5’-UTR) implying a translational regulation of iNOS expression and could be an evolutionary advantage which may open a new level of iNOS regulation. Reportergene transfection experiments in human DLD1 cells revealed that the uORF, although translatable, seems not to inhibit the initiation of translation at the bona fide ATG. The data presented in this thesis clearly show that human iNOS translation is cap-dependent and the 5’-UTR of the iNOS mRNA contains no internal ribosome entry site. Translation of the bona fide coding sequence is most likely mediated by a leaky scanning mechanism, which is supported by the weak Kozak sequence of the uORF compared to the Kozak sequence of the main cds. The uORF stop codon is located upstream of the first intron, which indicates an involvement of the nonsense mediated RNA decay (NMD) in iNOS regulation. Downregulation of UPF1 by siRNA resulted in enhanced endogenous cytokine induced iNOS expression in human DLD1 cells and higher mRNA stability. Transfection of constructs containing iNOS exon 1, intron 1 and exon 2 upstream of a luciferase coding sequence showed a clear effect on luciferase reportergene expression, when the uORF-ATG was mutated. Thus, it is indicated that the uORF reduces the intensity of iNOS expression and its duration via the NMD mechanism. Besides the effect of the iNOS within the immune system, it seems to play an important role in neural development. High amounts of NO as well as the lack of iNOS expression or NO production lead to aberrative development and teratogenic effects. Sequence database and qRT-PCR analyses showed an upregulation of human iNOS mRNA expression during differentiation of hiPSC or hESC to neurons. 5’-RACE analysis showed that the iNOS mRNA expressed in the differentiating hiPSC contains an alternative neuron-specific exon 1 instead of the first two exons of the regular iNOS. Thus, this thesis presents a new iNOS transcript and isoform, which is expressed during the first stages of neural development and could be a target in new therapies, e.g. of neuro-degenerative diseases.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3100
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000034404
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIX, 205 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen