Authors:	Strüve, Marcel
Title:	Funktionelle Untersuchungen zur Rolle von Polyphosphat-bindenden Proteinen bei der Immunantwort
Online publication date:	17-Feb-2020
Year of first publication:	2020
Language:	german
Abstract:	Anorganische Polyphosphate (PolyP) sind poly-anionische Polymere, die aus über hochenergetische Phosphoanhydridbindungen verknüpften Monophoshateinheiten bestehen. Während Säugetier-Thrombozyten hohe Konzentrationen kurzkettiger PolyP, mit einer mittleren Kettenlänge von etwa 70 Monophosphateinheiten, enthalten, werden in Mikroorganismen langkettige PolyP von mehreren hundert Monophosphateinheiten Länge (L-PolyP) vorgefunden. Die bakterielle Akkumulation von L-PolyP erfolgt unter Bedingungen von Umweltstress und Nährstoffmangel und dient primär der Phosphat- und Energiespeicherung. Der Auf- und Abbau dieser Polymere wird dabei enzymatisch durch die Enzmye Polyphosphatkinase und Exopolyphosphatase katalysiert. Vor dem Hintergrund, dass L-PolyP bereits als Pathogenitätsfaktor humanpathogener Mikroorganismen beschrieben wurde, wurden im Rahmen dieser Dissertation die immunmodulatorischen Einflüsse von L-PolyP während systemischer bakterieller Infektion und der hierdurch bedingten, einsetzenden Entzündungsreaktion sowohl in vivo als auch in vitro untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass L-PolyP ein starker Induktor von PF4 ist, die LPS-induzierte Sekretion von IL-27 jedoch hemmt. Darüber hinaus reduziert Co-Stimulation mit L-PolyP die LPS-induzierte Heraufregulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS), sowie der TAP1 und Irg1-Transkritption. TAP1 ist an der Beladung von MHC-I Molekülen beteiligt, während Irg1 die enzymatische Produktion eines antimikrobiellen Metaboliten in Makrophagen katalysiert. Die Effektivität eines enzymatischen Verdaus des aus Mikroorganismen freigesetzten L-PolyP durch PPX als Sepsistherapie wurde in diesem Zusammenhang untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass das Überleben bereits einmalig nach Sepsisinduktion therapierter Tiere über den Beobachtungszeitraum gegenüber nicht behandelten Tieren signifikant verbessert ist. Das Versterben der Tiere gegenüber nicht behandelten Tieren setzte zudem verspätet ein. Zur Aufklärung, wie die vor allen in Makrophagen beobachteten zellulären Effekte durch L PolyP vermittelt werden, wurden in Vorarbeiten unserer Gruppe bereits mehrere potenzielle Rezeptorkandidaten identifiziert. Dafür wurden Daten genutzt, die einerseits aus Bindungsstudien mit L-PolyP maskierten Mikropartikeln und Gesamtzelllysaten muriner BMDM (bone marrow-derived macrophages) resultierten. Die Einzelproteine der gebundenen Proteinfraktion wurden dabei massenspektrometrisch identifiziert. Andererseits wurden im Rahmen der Vorarbeiten zudem stark L-PolyP und LPS regulierte Gene durch Transkriptomanalyse identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei der aus diesen der Arbeitsgruppe zur Verfügung stehenden Analysen übereinstimmend erhaltenen Kandidatengenen (MYADM, TMEM206 und TMCO1) genauer bezüglich ihrer immunologischen Funktion und ihrer Rolle in der Polyphosphatsignalgebung untersucht. Hierzu wurden globale MYADM und TMEM206 Knock-out Mäuse generiert. Tiere dieser neu generierten Stämme zeigten im unbehandelten Zustand keinen offenschtlichen Phänotyp, waren fertil und lebensfähig. BMDM dieser Tiere wurden bezüglich ihrer Responsivität gegenüber L-PolyP untersucht. Sowohl in MYADM-/- als auch TMEM206-/- Makrophagen wurde weiterhin eine Hemmung der IL-27 Sekretion sowie starke PF4-Induktion beobachtet. Die Konzentration der durch TMEM206 /- BMDM als Antwort auf LPS beziehungsweise L-PolyP sekretierten Cytokine IL 27 und PF4 war jedoch gegenüber dem Wildtyp erhöht. Darüber hinaus konnte eine geringere Phagocytoseleistung und NO-Produktion für die Knock-out-Makrophagen festgestellt werden. Starke TMEM206-Expression konnte primär in professionellen, Antigen-präsentierenden Zellen (B-Zellen, Makrophagen, Dendritische Zellen) lokalisiert werden. Für MYADM-/- Mäuse konnten signifikante Veränderungen in der Expression der aus Humandaten bekannten molekularen Interaktoren TGFβ-Rezeptor TGFBR2 und des IL-1 decoy-Rezeptors IL1R2 in Makrophagen gefunden werden, die auf eine immunmodulatorische Funktion von MYADM hindeuten. TMCO1-/- Tiere zeigten eine im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduzierte Viabilität und Fertilität. Im in vivo-Modell der Endotoxämie konnten signifikant erhöhte Konzentrationen der Cytokine MIP1α, MIP1β, RANTES und IL-10 als Antwort auf die durch LPS-induzierte Immunreaktion gefunden werden. Inorganic polyphosphates (PolyP) are poly-anionic polymers consisting of monophosphate units linked by high-energy phosphoanhydride bonds. The chain lengths of these polymers are highly variable reaching from about 70 monomer units in platelet PolyP to several hundred monophosphate units in bacteria. Bacterial accumulation of PolyP takes place under conditions of environmental stress or scarcity of nourishing factors and serves primarily phosphate- and energy storage. Enzymatic processes are used to build and elongate PolyP chains as well as for degradation. Transfer of phosphate monomers from ATP to the growing PolyP chain is facilitated by polyphosphate kinases (PPK) while degradation occurs by the activity of exopolyphosphatase (PPX). Since long-chain PolyP (L-PolyP) were described as virulence factors of human pathogenic bacteria in the past, the immune modulatory effects of L-PolyP during systemic bacterial infection and inflammation were assessed by this work using both in vitro and in vivo methods. In in vitro experiments with bone-marrow derived macrophages (BMDM), L-PolyP was identified as a strong inductor of the PF4 (CXCL4) cytokine and an inhibitor of LPS-induced IL-27 and IP-10/CXCL10 secretion as well as LPS-induced iNOS expression in macrophages. Furthermore, LPS-induced TAP1, which is involved in antigen presentation by loading of MHC-I molecules and Irg1 expression, coding for the enzyme producing the antimicrobial metabolite itaconate, was significantly inhibited by L-PolyP. After all the identified immunesuppressive effects of L-PolyP, efficiency of L-PolyP digestion as a therapeutic approach, was assessed in vitro and in vivo. In macrophage culture, L PolyP digestion by recombinant PPX was able to fully suppress the L-PolyP effects on IL 27 secretion. Furthermore, the therapeutic capacity was assessed in vivo in a model of CLP-induced sepsis. A one-time therapeutic dose of PPX applied three hours after sepsis induction, significantly reduced mortality of the treated mice as compared to control mice given sodium chloride solution only. Treated mice also died at later time points than control mice. In order to identify possible receptor candidates, mediating the observed immune modulatory effects of L-PolyP, binding experiments with BMDM whole cell lysates were performed by our work group. Here, these data were analyzed for PolyP-binding proteins identified by mass spectrometry. Furthermore, strongly LPS-regulated and L-PolyP influenced genes were identified by analyzing the existing data sets from RNA-sequencing transcriptomics. By these means, three candidate genes, namely TMEM206, MYADM and TMCO1 were identified to be assessed further. Therefore, global knock-out mice for TMEM206 and MYADM were generated using CRISPR/Cas9-mediated genome editing. These newly generated mouse strains were viable and fertile and showed no obvious aberrant bodily phenotypes. IL-27 secretion of TMEM206-/- BMDM in response to LPS, however, was significantly increased as compared to wildtype cells. Furthermore, reduced NO productions by these cells as well as reduced phagocytosis capacity was detected. The main immune cell populations expressing TMEM206 were identified using flow cytometry. Signifant TMEM206 was found only in professional antigen presenting cells (APCs), namely macrophages/BMDMs, B cells and dendritic cells. These findings suggest that TMEM206 might modulate the inflammatory response in vitro and in vivo, however, the inhibition of IL-27 as well as the induction of PF4 by L-PolyP were still observed in TMEM206 /- BMDM. For MYADM knock-out animals, significantly reduced transcriptomic levels of the known molecular interactors TGF-beta receptor 2 (TGFBR2) and IL-1 decoy receptor (IL1R2) were found, suggesting an immune modulatory function of MYADM. TMCO1-/- animals showed severely reduced fertility and impaired viability. In an in vivo model using LPS-induced endotoxemia, significantly increased concentrations of MIP1-α, MIP1-β, RANTES and IL-10 were found as compared to appropriate control mice, suggesting a function of TMCO1 in regulating the cell-based immune response.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3096
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000034195
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIII, 133 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen