Funktionelle Untersuchungen zur Rolle von Polyphosphat-bindenden Proteinen bei der Immunantwort
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Anorganische Polyphosphate (PolyP) sind poly-anionische Polymere, die aus über hochenergetische Phosphoanhydridbindungen verknüpften Monophoshateinheiten bestehen. Während Säugetier-Thrombozyten hohe Konzentrationen kurzkettiger PolyP, mit einer mittleren Kettenlänge von etwa 70 Monophosphateinheiten, enthalten, werden in Mikroorganismen langkettige PolyP von mehreren hundert Monophosphateinheiten Länge (L-PolyP) vorgefunden. Die bakterielle Akkumulation von L-PolyP erfolgt unter Bedingungen von Umweltstress und Nährstoffmangel und dient primär der Phosphat- und Energiespeicherung. Der Auf- und Abbau dieser Polymere wird dabei enzymatisch durch die Enzmye Polyphosphatkinase und Exopolyphosphatase katalysiert.
Vor dem Hintergrund, dass L-PolyP bereits als Pathogenitätsfaktor humanpathogener Mikroorganismen beschrieben wurde, wurden im Rahmen dieser Dissertation die immunmodulatorischen Einflüsse von L-PolyP während systemischer bakterieller Infektion und der hierdurch bedingten, einsetzenden Entzündungsreaktion sowohl in vivo als auch in vitro untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass L-PolyP ein starker Induktor von PF4 ist, die LPS-induzierte Sekretion von IL-27 jedoch hemmt. Darüber hinaus reduziert Co-Stimulation mit L-PolyP die LPS-induzierte Heraufregulation der induzierbaren NO-Synthase (iNOS), sowie der TAP1 und Irg1-Transkritption. TAP1 ist an der Beladung von MHC-I Molekülen beteiligt, während Irg1 die enzymatische Produktion eines antimikrobiellen Metaboliten in Makrophagen katalysiert. Die Effektivität eines enzymatischen Verdaus des aus Mikroorganismen freigesetzten L-PolyP durch PPX als Sepsistherapie wurde in diesem Zusammenhang untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass das Überleben bereits einmalig nach Sepsisinduktion therapierter Tiere über den Beobachtungszeitraum gegenüber nicht behandelten Tieren signifikant verbessert ist. Das Versterben der Tiere gegenüber nicht behandelten Tieren setzte zudem verspätet ein.
Zur Aufklärung, wie die vor allen in Makrophagen beobachteten zellulären Effekte durch L PolyP vermittelt werden, wurden in Vorarbeiten unserer Gruppe bereits mehrere potenzielle Rezeptorkandidaten identifiziert. Dafür wurden Daten genutzt, die einerseits aus Bindungsstudien mit L-PolyP maskierten Mikropartikeln und Gesamtzelllysaten muriner BMDM (bone marrow-derived macrophages) resultierten. Die Einzelproteine der gebundenen Proteinfraktion wurden dabei massenspektrometrisch identifiziert. Andererseits wurden im Rahmen der Vorarbeiten zudem stark L-PolyP und LPS regulierte Gene durch Transkriptomanalyse identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei der aus diesen der Arbeitsgruppe zur Verfügung stehenden Analysen übereinstimmend erhaltenen Kandidatengenen (MYADM, TMEM206 und TMCO1) genauer bezüglich ihrer immunologischen Funktion und ihrer Rolle in der Polyphosphatsignalgebung untersucht.
Hierzu wurden globale MYADM und TMEM206 Knock-out Mäuse generiert. Tiere dieser neu generierten Stämme zeigten im unbehandelten Zustand keinen offenschtlichen Phänotyp, waren fertil und lebensfähig. BMDM dieser Tiere wurden bezüglich ihrer Responsivität gegenüber L-PolyP untersucht. Sowohl in MYADM-/- als auch TMEM206-/- Makrophagen wurde weiterhin eine Hemmung der IL-27 Sekretion sowie starke PF4-Induktion beobachtet. Die Konzentration der durch TMEM206 /- BMDM als Antwort auf LPS beziehungsweise L-PolyP sekretierten Cytokine IL 27 und PF4 war jedoch gegenüber dem Wildtyp erhöht. Darüber hinaus konnte eine geringere Phagocytoseleistung und NO-Produktion für die Knock-out-Makrophagen festgestellt werden. Starke TMEM206-Expression konnte primär in professionellen, Antigen-präsentierenden Zellen (B-Zellen, Makrophagen, Dendritische Zellen) lokalisiert werden. Für MYADM-/- Mäuse konnten signifikante Veränderungen in der Expression der aus Humandaten bekannten molekularen Interaktoren TGFβ-Rezeptor TGFBR2 und des IL-1 decoy-Rezeptors IL1R2 in Makrophagen gefunden werden, die auf eine immunmodulatorische Funktion von MYADM hindeuten.
TMCO1-/- Tiere zeigten eine im Vergleich zum Wildtyp deutlich reduzierte Viabilität und Fertilität. Im in vivo-Modell der Endotoxämie konnten signifikant erhöhte Konzentrationen der Cytokine MIP1α, MIP1β, RANTES und IL-10 als Antwort auf die durch LPS-induzierte Immunreaktion gefunden werden.