Authors:	Hammes, Bodo
Title:	Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese
Online publication date:	18-Feb-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden. The presented dissertation concerning the biosynthesis of indole alkaloids in plants can be subdivided in a part dealing with molecular biology and one dealing with protein analytics. In molecular biology the development of a new expression system was aspired. With this vector a parallel expression of multiple enzymes should be enabled in bacterial strains. For this purpose the cDNA of strictosidine synthase from Rauvolfia serpentina was cloned in the expression vector pQE-70. For preliminary work on other coexpression systems a 253 bp fragment of the multiple cloning site from pSE-280 vector was added to the 3’ end of the strictosidine synthase cDNA. With this step the multiple cloning site of the used expression system was extended in order to express at least 6 additional genes or gencluster in one vector system. After proving its function the received plasmid was expanded by a strictosidine-β-D-glucosidase gene also taken from Rauvolfia serpentina. In order to allow smooth parallel expression of both enzymes an internal ribosome binding site (shine-dalgarno sequence) was inserted between both genes. After expression in E. coli strain M15 and feeding of tryptamine and secologanin the endproducts of the coupled enzyme assay were identified as cathenamine and its reduced product tetrahydroalstonin by HPLC, TLC and EI-MS analysis. During the second part of the experimental work a protein purification could be developed. Within this work the NADPH dependant enzyme cathenamine reductase was obtained. This protein was characterized in regard to molecular weight, pH optimum and cofactor dependency. The sequence of the enzyme could not be determined up to date. Synthesis of raubasine, 19-Epi-Raubasine and tetrahydroalstonine out of cathenamine is catalyzed by at least two enzymes.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3086
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-6940
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen