Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen
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Etablierung von Expressionsystemen für Gene der
Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer
Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen
In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme aus der Arzneipflanze Rauvolfia
serpentina bearbeitet. Es wurde versucht, das an der Biosynthese des Alkaloids
Ajmalin beteiligte Cytochrom P450-Enzym Vinorin-Hydroxylase heterolog und
funktionell zu exprimieren.
Ein zunächst unvollständiger, unbekannter Cytochrom P450-Klon konnte
komplettiert und eindeutig mittels heterologer Expression in sf9-Insektenzellen
als Cinnamoyl-Hydroxylase identifiziert
werden. Die Tauglichkeit des
Insektenzellsystems für die Untersuchung der Vinorin-Hydroxylase ist auf
Grund der deacetylierenden Wirkung der Insektenzellen auf das Substrat
Vinorin nicht gegeben.
Im Rahmen des Homology Cloning Projektes konnten mehrere Volllängenklone
und diverse Teilsequenzen von neuen Cytochrom P450-Klonen ermittelt
werden. Ausserdem wurde durch das unspezifische Binden eines degenerierten
Primers ein zusätzlicher Klon gefunden, der der Gruppe der löslichen
Reduktasen zugeordnet werden konnte. Diese putative Reduktase wurde auf
die Aktivität von mehreren Schlüsselenzymen der Ajmalin-Biosynthese durch
heterologe Expression in E.coli und anschliessende HPLC-gestützte
Aktivitätstests ohne Erfolg geprüft.
Bedingt durch die Untauglichkeit des Insektenzellsystems für die Identifizierung
der Vinorin-Hydroxylase, wurde ein neuartiges Modul-gestütztes, pflanzliches
Expressionsystem etabliert, um vorhandene P450-Volllängenklone auf Vinorin-
nHydroxylaseaktivität testen zu können. Die Funktionalität des Systems konnte
durch die heterologe Expression der Polyneuridinaldehyd Esterase bestätigt
werden. Trotzdem war es bis jetzt nicht möglich, die Cinnamoyl-Hydroxylase als
Kontrollenzym für das pflanzliche System oder aber die gesuchte Vinorin-
Hydroxylase in aktiver Form zu exprimieren.