Authors:	Woll, Jörn
Title:	Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen
Online publication date:	3-Feb-2005
Year of first publication:	2005
Language:	german
Abstract:	Etablierung von Expressionsystemen für Gene der Indolalkaloid-Biosynthese unter besonderer Berücksichtigung von Cytochrom P450-Enzymen In der vorliegenden Arbeit wurden Enzyme aus der Arzneipflanze Rauvolfia serpentina bearbeitet. Es wurde versucht, das an der Biosynthese des Alkaloids Ajmalin beteiligte Cytochrom P450-Enzym Vinorin-Hydroxylase heterolog und funktionell zu exprimieren. Ein zunächst unvollständiger, unbekannter Cytochrom P450-Klon konnte komplettiert und eindeutig mittels heterologer Expression in sf9-Insektenzellen als Cinnamoyl-Hydroxylase identifiziert werden. Die Tauglichkeit des Insektenzellsystems für die Untersuchung der Vinorin-Hydroxylase ist auf Grund der deacetylierenden Wirkung der Insektenzellen auf das Substrat Vinorin nicht gegeben. Im Rahmen des Homology Cloning Projektes konnten mehrere Volllängenklone und diverse Teilsequenzen von neuen Cytochrom P450-Klonen ermittelt werden. Ausserdem wurde durch das unspezifische Binden eines degenerierten Primers ein zusätzlicher Klon gefunden, der der Gruppe der löslichen Reduktasen zugeordnet werden konnte. Diese putative Reduktase wurde auf die Aktivität von mehreren Schlüsselenzymen der Ajmalin-Biosynthese durch heterologe Expression in E.coli und anschliessende HPLC-gestützte Aktivitätstests ohne Erfolg geprüft. Bedingt durch die Untauglichkeit des Insektenzellsystems für die Identifizierung der Vinorin-Hydroxylase, wurde ein neuartiges Modul-gestütztes, pflanzliches Expressionsystem etabliert, um vorhandene P450-Volllängenklone auf Vinorin- nHydroxylaseaktivität testen zu können. Die Funktionalität des Systems konnte durch die heterologe Expression der Polyneuridinaldehyd Esterase bestätigt werden. Trotzdem war es bis jetzt nicht möglich, die Cinnamoyl-Hydroxylase als Kontrollenzym für das pflanzliche System oder aber die gesuchte Vinorin- Hydroxylase in aktiver Form zu exprimieren. "Establishing of expressionsystems for genes of the indolalkaloide biosynthesis in consideration of P450s” The actual thesis is about the working with enzymes of the medicinal plant Rauvolfia serpentina. It was tried to investigate the vinorine-hydroxylase (VH) which is a P450 enzyme and catalizes the hydroxylation of the substrate vinorine. It was possible to complete a fragment of a unknown p450 clone and to identify as cinnamicacid-hydroxylase by heterologous expression in sf9-insect cells with the nbaculovirussystem. It is not possible to test P450 clones for VH-activity because of the deacetylation of the vinorine thru the insectcells. The result of the homology cloning were several parts of sequences of P450-clones and three fulllengthclones. With the unspecific binding of degenerated primers it was found the sequence of a unknown soluble reductase of R. serpentina. The identity of this reductase is still not known nevertheless the testing for the activity of some important reductases of R. serpentina. It was also possible to establish a new plant expression system which is based on the disposition of different modules to synthesis the final expression vector, the recombinant Tobacco Mosaic Virus, in the plant cell after infiltration with Agrobacterium tumefaciens. This expressionsystem was used to try the expression of the desirded P450 clones in Nicotiana benthamiana which is the host plant of the system. The functionality of the system was proved with the expression of the polyneuridine aldehyd esterase of Rauvolfia serpentina. Up to now it was not possible to express the cinnamic acid hydroxylase in a active way as a positive control enzyme for the expression of P450s. Also it was not possible to express the VH in a active way.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3076
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-6810
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen