Authors:	Kumm, Elena Johanna
Title:	Analysis of the cell cycle regulatory system MASTL-ENSA/ARPP19-PP2A in human platelets
Online publication date:	7-Mar-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Small non-nucleated platelets, circulating in the blood, are activated upon vessel injury, to immediately stop the blood loss via thrombus formation. Under resting conditions, circulating platelets are inhibited through nitric oxide (NO, activating protein kinase G (PKG)) or prostacyclin (PGI2, activating protein kinase A (PKA)). These inhibitors induce phosphorylation of multiple proteins inside the platelet to inhibit platelet activation and signaling pathways. Platelet signal transduction upon activation or inhibition is regulated through protein kinases and phosphatases. A full phosphoproteomic study headed by PD Dr. K. Jurk and Dr. R. Zahedi with inhibited human platelets (data unpublished), revealed a high number of proteins regulated upon PKA and PKG activation. Two proteins, α-endosulfine (ENSA or ARPP19e) and cAMP-regulated phosphoprotein 19 (ARPP19), were strongly phosphorylated at S109/S104 (ENSA/ARPP19) in response to PKA and PKG activation (PKG effect was unknown before). The functional role of the PKA phosphorylation of ENSA and ARPP19 (identified years ago in different cell systems) is still unknown. The phosphorylation of ENSA/ARPP19 at S67/S62 via the Greatwall kinase in Drosophila, Xenopus and yeast and in mammalian cells by its homolog, the microtubule-associated serine/threonine kinase-like (MASTL), converts ENSA and ARPP19 to strong inhibitors of the protein phosphatase PP2A resembling the pharmacological inhibitor okadaic acid (OA). In dividing cells, this PP2A regulation is important for the cell cycle control; it is not reported for platelets so far. The overall aim of this thesis was to elucidate the regulation and function of ENSA S67/S109 and ARPP19 S62/S104 phosphorylation in human platelets and the relation to the MASTL-ENSA/ARPP19-PP2A regulatory mechanism. As experimental approaches, ENSA and ARPP19 phosphorylation was analyzed by recombinant MASTL, recombinant PKG and purified PKA, as well as ENSA and ARPP19 phosphorylation at S67/S62 in intact human platelets and platelet lysates. The influence of recombinant pS67 ENSA/pS62 ARPP19 on platelet PP2A activity and the functional relevance of PP2A inhibition for platelet activation was investigated. ENSA, ARPP19 and PP2A, but not MASTL, were detected in human platelets at significant protein levels. ENSA, cloned from human platelets, was expressed in HEK293 cells and E.coli BL21, on top, recombinant HisENSA was purified from BL21. ENSA and ARPP19 phosphorylation was studied with intact human platelets, platelet lysates and recombinant proteins as well as with ENSA phosphosite-mutants. ENSA S67/ARPP19 S62 phosphorylation was elevated upon phosphatase PP1/PP2A inhibition with OA for endogenous ENSA, recombinant ARPP19 and wild type ENSA in human platelet lysates, and in intact platelets. These data clearly demonstrated the presence of a MASTL-like kinase activity in human platelets. A broad spectrum of PP2A holoenzymes was shown to be present in human platelets. pS67 HisENSA and pS62 GST-ARPP19 reduced platelet PP2A activity of about 20% (compared to unphosphorylated control) in platelet lysates, using a PP2A specific non-radioactive serine/threonine phosphatase activity assay. With 1 nM of OA, platelet PP2A activity was completely inhibited. The phosphorylation of PP2A substrates (vasodilator-stimulated phosphoprotein, VASP, and mitogen-activated protein kinase (MAPK), p38) was increased in low dose OA treated isolated human platelets. The same concentration of OA decreased platelet activation/aggregation upon thrombin stimulation, revealing a regulatory role of PP2A upon platelet activation mechanisms in human platelets. Based on these results, it can be concluded that human platelets contain all components of the [MASTL-like]–ENSA/ARPP19–PP2A (B55/B56) pathway, which is essential for the cell cycle control but must have other function(s) in non-dividing platelets. In the future it will be important to elucidate the molecular and functional targets of the [MASTL-like]-ENSA/ARPP19-PP2A pathway in human platelets. Zellkernlose Thrombozyten, die kleinsten Zellen des Blutes, zirkulieren im Blutkreislauf. Wird eine Gefäßwand verletzt, werden Thrombozyten aktiviert, um die Blutung schnellstmöglich durch die Bildung eines Thrombus zu stillen. Um eine ungewollte Aktivierung der Thrombozyten zu verhindern, werden sie durch Endothelzellen, die Stickstoffmonoxid (NO) (Aktivierung von Protein Kinase G (PKG)), oder Prostacyclin (PGI2) (Aktivierung von Protein Kinase A (PKA)) freisetzen, negativ reguliert. PKA und PKG inhibieren Thrombozyten-Aktivierungssignalwege durch die Phosphorylierung diverser Proteine. Signalübertragungen werden generell durch Proteinkinasen und Proteinphosphatasen innerhalb einer Zelle reguliert. Eine umfangreiche Phosphoproteom-Studie von inhibierten humanen Thrombozyten (Daten noch nicht publiziert) unter der Leitung von Frau PD Dr. K. Jurk und Herrn Dr. R. Zahedi identifizierte diverse Proteine, die durch PKA und PKG phosphoryliert und somit reguliert werden. Zwei Proteine, α-Endosulfin (ENSA bzw. ARPP19e) und cAMP-reguliertes Phosphoprotein 19 (ARPP19), werden an S109/S104 durch PKA und PKG stark phosphoryliert (dass PKG die beiden Proteine ebenfalls phosphoryliert, war vorher nicht bekannt). Die PKA Phosphorylierung von ENSA und ARPP19 ist in mehreren Zellsystemen seit Jahren bekannt, aber die Funktion ist bis heute nicht geklärt. Eine Phosphorylierung von ENSA/ARPP19 an S67/S62 durch die „Greatwall Kinase“ (in Drosophila, Xenopus und Hefen) bzw. ihr Homolog in Säugetierzellen, die „microtubule-associated serine/threonine kinase-like“ MASTL Kinase, macht aus ENSA und ARPP19 extrem starke Inhibitoren der Protein Phosphatase PP2A, ähnlich zu dem pharmakologischen Inhibitor Okadasäure (OA). Diese PP2A Regulierung ist in sich teilenden Zellen sehr wichtig für die Kontrolle des Zellzyklus, sie wurde in Thrombozyten bis jetzt noch nicht beobachtet. Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Regulierung und Funktion der ENSA S67/S109 und der ARPP19 S62/S104 Phosphorylierung in humanen Thrombozyten und die Verbindung zu dem MASTL-ENSA/ARPP19-PP2A Regulierungsmechanismus zu identifizieren. Dafür wurde die ENSA und ARPP19 Phosphorylierung durch rekombinante MASTL, rekombinante PKG und gereinigte PKA analysiert. Zusätzlich wurde die ENSA und ARPP19 Phosphorylierung an S67/S62 in intakten humanen Thrombozyten und Thrombozytenlysaten untersucht. Der Einfluss von pS67 ENSA/pS62 ARPP19 auf die Aktivität von PP2A in Thrombozyten sowie die funktionelle Relevanz der PP2A Hemmung auf die Thrombozyten-Aktivierung wurde überprüft. Die Proteine ENSA, ARPP19 und PP2A, aber nicht die MASTL Kinase, wurden abundant in humanen Thrombozyten detektiert. ENSA, kloniert aus humanen Thrombozyten, wurde in HEK293 Zellen und in E.coli BL21 exprimiert und aus E.coli als rekombinantes His-getaggtes Protein gereinigt. Die Phosphorylierung von ENSA und ARPP19 wurde in intakten humanen Thrombozyten, in Thrombozytenlysaten und unter Verwendung der rekombinanten Proteine, sowie den S67 und S109 Mutanten von HisENSA untersucht. Die ENSA S67/ARPP19 S62 Phosphorylierung wurde durch die Inhibierung von PP1/PP2A mittels OA für endogenes ENSA, rekombinantes ARPP19 und ENSA (Wildtyp) in humanen intakten Thrombozyten und in Thrombozytenlysaten stark erhöht. Durch diese Versuche konnte eine MASTL-ähnliche Kinase und ihre Aktivität in humanen Thrombozyten eindeutig nachgewiesen werden. Verschiedene PP2A Holoenzyme wurden in humanen Thrombozyten detektiert. S67 phosphoryliertes rekombinantes ENSA sowie pS62 ARPP19 reduzierten die Aktivität von PP2A in humanen Thrombozytenlysaten um ca. 20% (verglichen mit unphosphoryliertem Protein). Die Hemmung wurde mit Hilfe eines nicht-radioaktiven Serin/Threonin Phosphatase-Aktivitäts-Assays bestimmt. Im Vergleich, 1 nM OA hemmte die PP2A Aktivität in Thrombozytenlysaten vollständig. Bekannte PP2A Substrate („vasodilator-stimulated phosphoprotein“ (VASP) und die mitogen-aktivierte Proteinkinase p38) waren stärker phosphoryliert, wenn isolierte humane Thrombozyten mit geringen Mengen OA inkubiert wurden. Die gleiche Konzentration OA führte zu einer Reduktion der Thrombin-induzierten Aktivierung/Aggregation von humanen Thrombozyten. Dies deutet auf eine Rolle von PP2A innerhalb der Regulierung von humanen Thrombozyten-Aktivierungsmechanismen hin. Auf Grund der oben genannten Ergebnisse lässt sich schlussfolgern, dass humane Thrombozyten alle Bestandteile des [MASTL-like]-ENSA/ARPP19-PP2A (B55/56) Netzwerks besitzen, welche für die Kontrolle des Zellzyklus essentiell sind und in sich nicht teilenden Thrombozyten eine andere Funktion erfüllen müssen. Für die Zukunft ist es wichtig, die beteiligten Proteine und die Funktionen des [MASTL-like]-ENSA/ARPP19-PP2A Signalwegs in humanen Thromboyzten zu identifizieren und zu erforschen.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch. FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3038
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000026842
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	3, 133 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen