Authors:	Bhatti, Anita
Title:	Exploring human T lymphocytes expressing a CAR directed to the tumor-neoantigen EGFRvIII for adoptive cellular therapy to non-small cell lung cancer
Online publication date:	7-Mar-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Adoptive cellular therapy (ACT) using genetically engineered T cells expressing a chimeric-antigen-receptor (CAR) to redirect their specificity holds great promise in tumor immunotherapy. However, in contrast to remarkable clinical responses observed with CD19-CAR T cells for B-cell leukemias, efficacy of ACT in solid tumors is often hampered by insufficient and non-durable immunity of T cells facing an immunosuppressive tumor microenvironment. Moreover, identifying tumor-specific neoantigens with low off-target activity is difficult. The epithelial growth factor variant III (EGFRvIII) is only found on neoplastic tissue and represents a promising candidate target for ACT in e.g. glioblastoma as already shown in clinical trials and has also been described for non-small cell lung cancer (NSCLC). EGFRvIII-CAR T cells have not yet been tested in NSCLC, we therefore aimed in this preclinical study to evaluate antitumor immunity of EGFRvIII-CAR T cells against NSLCL in vitro and in vivo using a xenograft mouse model. Human, preactivated T cells were retrovirally transduced, and CAR expression was analyzed by flow cytometry 7 days (d) post transduction. Stably transfecetd EGFRvIII+ cells of a HLA class I/II-deficient melanoma cell line (Ma-Mel-86) or the NSLCL cell line A549 were used as targets. EGFRvIII-CAR T cells were examined for IFN-γ/Granzyme B release and cytotoxicity using ELISpot-, 51Cr-release- and 48h co-culture assays. To evaluate the therapeutic potential in vivo, intratumoral T-cell transfer into NSG mice displaying palpable subcutaneous tumor engraftment was performed. Upon retroviral transduction >85% T cells expressed the EGFRvIII-CAR as confirmed by flow cytometry. EGFRvIII-CAR T cells induced vigorous responses to both EGFRvIII+ tumor targets in vitro as measured by IFN-γ and Granzyme B release and elicited potent cytotoxicity (>60%) upon short-term 5h coculture (51Cr-release) and >90% in co-culture assays after 2d. Moreover, we generated EGFRvIII-CAR redirected T cells derived from naïve, CD45RA+ precursors displaying a stem cell and central memory phenotype, which have been previously reported to elicit superior antitumor immunity as compared to more differentiated T cells. The less differentiated EGFRvIII-CAR redirected T cells showed comparable anti-EGFRvIII responses when compared to EGFRvIII-CAR T cells obtained from bulk cultures regarding stimulation activity and cytokine response. In this study we could prove effective reactivity of EGFRvIII-CAR T cells towards EGFRvIII-expressing melanoma and lung cancer cells in vitro. To evaluate the therapeutic potential of EGFRvIII-CAR T cells in vivo, further exploitation and optimization regarding the mouse model is required to overcome obstacles we encountered in preliminary studies. Although EGFRvIII appears not to be a dominant target among the different EGFR mutations found in NSCLC patients, EGFRvIII-CAR ACT might provide valuable information as a proof of concept study for immunotherapy in lung cancer and might contribute to improve ACT for solid tumors. Die adoptive zelluläre Immuntherapie (ACT), die genetisch modifizierte T-Zellen verwendet, die einen chimärischer Antigen-Rezeptor (CAR) exprimieren, um die T-Zell Spezifität zu reprogrammieren, stellt eine vielversprechende Methode bei der Immuntherapie von Tumoren dar. CD19-CAR T-Zellen konnten bereits beträchtliche klinische Ergebnisse bei der Behandlung von B-Zell Leukämien erzielen. Bei der Behandlung von soliden Tumoren allerdings, wird das Potenzial der ACT durch eine unzureichende und kurzlebige Immunität der T-Zellen, die auf ein immun-suppressives Tumormilieu stoßen, unterdrückt. Des Weiteren ist es äußerst schwierig ein tumorspezifisches Neoantigen zu identifizieren, welches eine geringe off-target Aktivität besitzt. Das EGFRvIII ist ausschließlich auf malignen Geweben exprimiert und zeichnet sich daher als ein vielsprechendes Antigen für die ACT bei der Behandlung von beispielsweise Glioblastomen aus, für welche bereits klinische Studien anstehen. Da EGFRvIII-CAR T-Zellen bisher nicht für die Behandlung vom nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) untersucht wurden, war es unser Ziel, die anti-Tumor Immunität von EGFRvIII-CAR T- Zellen gegen NSCLC sowohl in vitro als auch in vivo mithilfe eines Xenograft Tumormodells zu evaluieren. Humane, zuvor aktivierte T-Zellen wurden retroviral transduziert, und die CAR Expression wurde mittels Durchflusszytometrie 7 Tage nach Transduktion analysiert. Stabil transfizierte EGFRvIII+ Zellen einer HLA Klasse-I/II defizienten Melanom Zelllinie (Ma-mel86) und die Adenomakarzinoma Zelllinie A549 dienten als Targetzellen. EGFRvIII-CAR T-Zellen wurden mittels ELISpot-, 51Cr-Freisetzungs-, und Ko-Kultur Assays auf ihre Funktionalität untersucht. Zur Evaluierung des therapeutischen Potenzials in vivo, wurde ein T-Zell Transfer in NSG Mäusen durchgeführt, die zuvor mit EGFRvIII+ Tumorzellen engraftet wurden. EGFRvIII-CAR T-Zellen induzierten starke Reaktivitäten gegen EGFRvIII+ Targetzellen in vitro, ermittelt anhand der Ergebnisse der ELISpot Assays und spiegelten eindeutige Zytotoxizität sowohl im 51Cr-Freisetzungsassay (<60%) als auch im 48h Ko-Kultur Assay (<90%) wider. Zudem haben wir EGFRvIII-CAR T-Zellen generiert, die von naiven CD45RA+ T-Zellen stammen, und einen stem cell memory (TSCM) Phänotyp aufweisen. Diese sind beschrieben worden, eine verbessere anti-Tumor Aktivität im Vergleich zu weiter differenzierten T-Zellen auszuüben. Die TSCM EGFRvIII-CAR T-Zellen zeigten eine vergleichbar gute anti-Tumor Aktivität im Vergleich zu den weiter differenzierten unselektierten total EGFRvIII-CAR T-Zellen hinsichtlich der Stimulation und Zytokin Sekretion von IFN-γ und Granzym B gegen EGFRvIII+ Targetzellen in vitro. Um das therapeutische Potenzial der EGFRvIII-CAR T-Zellen in vivo genauer zu examinieren, ist eine Optimierung und genauere Betrachtung des Xenograft Mausmodells notwendig, um Problemstellungen zu lösen, auf die wir in den präklinischen Studien gestoßen sind. Auch wenn EGFRvIII nicht zu den dominant auftretenden Mutationen beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom zählt, könnte die EGFRvIII-CAR Therapie wertvolle Informationen als Proof of Concept Studie für die Immuntherapie von Lungenkrebs liefern und möglicherweise dazu beitragen, die ACT für solide Tumore zu verbessern.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3037
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000026826
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	117 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen