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Authors: Borisova, Marina E.
Title: p38-MK2 signaling axis regulates RNA metabolism after UV-light-induced DNA damage
Online publication date: 21-Feb-2019
Language: english
Abstract: Ultraviolet (UV) light radiation induces the formation of bulky photoproducts in DNA, resulting in the activation of the DNA damage response. This has a global effect on transcription and splicing. The components and regulatory mechanisms of DNA repair are relatively well established. However, an understanding of the signaling pathway that orchestrates complex changes in transcription and RNA metabolism after UV-light-induced DNA damage is only beginning to emerge. The p38 mitogen-activated protein kinases (MAPK) is a key transducer of cellular stress signaling and is activated by a number of stress-inducing agents, including UV-light. The activation leads to the phosphorylation of other serine/threonine (S/T) kinases, namely MK2, MK3, and MK5 (MK2/3/5). These kinases, in turn, phosphorylate a number of substrates that affect the functionality of diverse cellular processes, such as cell cycle progression, transcription, translation, splicing, and protein trafficking. Phosphorylation by S/T kinases can be recognized by 14-3-3 proteins. The crosstalk between p38 MAPK activation and 14-3-3 recognition has been demonstrated for a few proteins but has not yet been established as a mode of signaling. Here, we employ quantitative phosphoproteomics and protein kinase inhibition to provide a systems-wide view on protein phosphorylation patterns induced by UV-light and uncover the dependencies of phosphorylation events on canonical DNA damage signaling by the S/T kinases ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ataxia telangiectasia and Rad3-related (ATR) and the p38 MAPK pathway. Our data provide evidence that the activation of the p38 MAPK pathway is independent of the ATM/ATR pathways and regulates a different subset of proteins after low dosages of UV-C light. We detect the phosphorylation of p38 MAPK as well as its downstream kinases, MK2/3, shortly after radiation and observe it for up to one-hour. The p38 MAPK acts primarily through the MK2/3 kinase, which recognizes the LXRQX[ST] motif on the substrates. The same motif, when it is phosphorylated, is also recognized by the 14-3-3 family. We identify RNA-binding proteins as primary substrates and 14-3-3 as a direct “reader” of p38-MK2-dependent phosphorylation induced by UV-light. We mechanistically demonstrate that MK2 phosphorylates the RNA-binding subunit of the NELF complex, NELFE, on serine 49 (S49), S51, S115, and S251. NELFE phosphorylation promotes the recruitment of 14-3-3. Further analysis has determined that S115 plays the crucial role in 14-3-3 binding. This interaction between NELFE and 14-3-3 leads to the rapid dissociation of the NELF complex from chromatin. Aligned with this finding, we discover that the transient knockdown of NELFE results in an increased sensitivity of cells to UV-light. Our ChIP-seq analysis demonstrates that the NELF release is accompanied by RNA polymerase II elongation. Altogether, these events seem to promote cell survival during the response to UV-light DNA damage.
UV-Strahlung induziert die Bildung von sperrigen Fotoprodukten in der DNA, was zur Aktivierung der DNA-Schadensfunktion führt. Dies hat einen globalen Einfluss auf die Transkription und das Spleißen. Die Komponenten und Regulationsmechanismen der DNA-Reparatur sind relativ gut etabliert. Ein Verständnis des Signalwegs, der komplexe Veränderungen in der Transkription und im RNA-Stoffwechsel nach UV-Licht-induzierten DNA-Schäden organisiert, beginnt sich jedoch erst zu entwickeln. Die p38 MAPK sind ein Schlüsselwandler für zelluläre Stresssignale und werden durch eine Reihe von Stress-induzierenden Substanzen aktiviert, darunter UV-Licht. Die Aktivierung führt zur Phosphorylierung anderer Serin/Threonin (S/T)-Kinasen, nämlich MK2, MK3 und MK5. Diese Kinasen wiederum phosphorylieren eine Reihe von Substraten, die die Funktionalität verschiedener Zellprozesse beeinflussen, wie z.B. Zellzyklusverlauf, Transkription, Translation, Spleißen und Proteinhandel. Die Phosphorylierung durch S/T-Kinasen kann an 14-3-3 Proteinen erkannt werden. Der Schnittpunkt zwischen p38 MAPK-Aktivierung und 14-3-3 Erkennung wurde für einige Proteine nachgewiesen, ist aber noch nicht als Signalisierungsmodus etabliert. Hier verwenden wir quantitative Phosphoproteomik und Proteinkinase-Hemmung, um einen systemweiten Überblick über die durch UV-Licht induzierten Proteinphosphorylierungsmuster zu erhalten und die Abhängigkeiten von Phosphorylierungsereignissen von kanonischen DNA-Schadenssignalen durch die S/T-Kinasen ATM und ATR und den p38 MAPK-Pfad zu entdecken. Unsere Daten liefern den Nachweis, dass die Aktivierung des p38 MAPK-Pfades unabhängig von den ATM/ATR-Pfaden ist und eine andere Teilmenge von Proteinen nach niedriger Dosierung von UV-C-Licht reguliert. Wir entdecken die Phosphorylierung von p38 MAPK sowie der nachgelagerten Kinasen MK2/3 kurz nach der Bestrahlung und beobachten sie bis zu einer Stunde lang. Die p38 MAPK wirkt hauptsächlich durch die MK2/3-Kinase, die das LXRQX[ST]-Motiv auf den Substraten erkennt. Das gleiche Motiv, wenn es phosphoryliert ist, wird auch von der Familie 14-3-3 erkannt. Wir identifizieren RNA-bindende Proteine als Primärsubstrate und 14-3-3 als direkten "Reader" der p38-MK2-abhängigen Phosphorylierung, die durch UV-Licht induziert wird. Wir zeigen mechanistisch, dass MK2 die RNA-bindende Untereinheit des NELF-Komplexes, NELFE, auf Serin 49 (S49), S51, S115 und S251 phosphoryliert. NELFE Phosphorylierung fördert die Rekrutierung von 14-3-3. Weitere Analysen haben ergeben, dass S115 die entscheidende Rolle bei der 14-3-3 Bindung spielt. Diese Interaktion zwischen NELFE und 14-3-3 führt zu einer schnellen Dissoziation des NELF-Komplexes vom Chromatin. Ausgehend von diesem Ergebnis stellen wir fest, dass der transiente Knock-down von NELFE zu einer erhöhten Empfindlichkeit der Zellen gegenüber UV-Licht führt. Unsere ChIP-seq-Analyse zeigt, dass die NELF-Freisetzung von der Verlängerung der RNA-Polymerase II begleitet wird. Insgesamtcheinen diese Ereignisse das Zellüberleben bei der Reaktion auf DNA-Schäden durch UV-Licht zu fördern.
DDC: 500 Naturwissenschaften
500 Natural sciences and mathematics
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3031
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: IV, 95 Blätter
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