Authors:	Szybinski, Jakub
Title:	Role of unphosphorylated STAT5 in maintenance of Acute Myeloid Leukemia cells
Online publication date:	18-Feb-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Background In its phosphorylated state, the Signal Transducer and Activator of Transcription 5 (STAT5) A and B form homo- or heterodimers, which bind to chromatin and activate expression of target genes. In leukemia models harboring FLT3-ITD, BCR-ABL or JAK2 mutations, constitutive phosphorylation of STAT5 activates key proliferation and survival transcriptional programs. Recent studies in mouse hematopoietic progenitor cells suggest a distinct function of unphosphorylated STAT5 (uSTAT5): via restricting the access of ERG to target genes uSTAT5 acts as a repressor of megakaryocytic transcriptional programs [1]. The goal of this study is to examine the biological role of uSTAT5A and B in acute myeloid leukemia (AML) and to explore their role as potential therapeutic targets. Results We initially screened a panel of human AML cell lines and patient samples for STAT5A and STAT5B expression and phosphorylation at defined tyrosine residues. Most of the samples displayed strong expression of both STAT5A and STAT5B. Phosphorylation of STAT5 proteins at tyrosine 694 (pSTAT5A) and 699 (pSTAT5B) residues was strongly dependent on the presence of FLT3-ITD mutations. To explore the role of uSTAT5A/B, we performed doxycycline-inducible, short-hairpin RNA (shRNA) mediated knock-down of STAT5A and STAT5B. Targeting STAT5A or STAT5B severely suppressed cell proliferation across the entire tested panel; nevertheless, differentiation assays revealed that only the suppression of uSTAT5B induced cellular differentiation. In line, gene expression profiling by high-throughput sequencing (RNA-seq), demonstrated enrichment of monocytic differentiation programs in the THP-1 cell line upon loss of uSTAT5B. To further assess the distinct effects of STAT5A and STAT5B, we performed SILAC-based mass spectrometry and identified several STAT5 interacting partners in AML cell lines. While uSTAT5A primarily was found to be associated with proteins involved in RNA processing and translation initiation pathways, uSTAT5B coprecipitated chromatin- and histone-binding proteins, such as the transcription factor ETV6 or the histone H3K4 demethylase KDM5C. Finally, to elucidate the role of STAT5 on leukemic cell function in a mouse model, Stat5fl/fl or Stat5fl/fl_Mx1-Cre bone marrow cells were transformed with a retroviral construct of Mll/Af9 and transplanted into lethally irradiated mice. In the second round of transplantations, we performed a pIpC induction of Mx-1-Cre recombinase to explore, whether complete excision of Stat5 can prevent leukemia development. Surprisingly, animals transplanted with Stat5-depleted MA9 cells died briefly after excision with median survival of 15 days, while median survival of the Stat5fl/fl control was 26 days. Bone marrow cells from both cohorts were investigated for the expression of CD11b and Gr-1, both markers of differentiated hematopoietic cells. Interestingly, the Stat5fl/fl_Mx1-Cre-MA9-group, depleted of Stat5, showed a strong increase in the double-positive cells compared to control group suggesting a more mature phenotype. Summary In summary, our data indicate that uSTAT5B is involved in the regulation of differentiation through modulation of the epigenetic landscape and transcriptional programs of leukemic cells. Targeting of uSTAT5B or its downstream pathways might represent an interesting novel strategy in AML treatment. HINTERGRUND Signal Transducer and Activator of Transcription (STAT) Proteine sind essentielle Mediatoren von externen Signalen in den Zellkern. Insgesamt können 7 Mitglieder unterschieden werden (STAT1-6), wobei für STAT5 die Isoformen STAT5A und -B existieren. Nach Aktivierung von Rezeptoren der Zelloberfläche kommt es zur Phosphorylierung von STAT5A und -B, zur Bildung von Homo- oder Heterodimeren und einer Translokation in den Nukleus, wo dann ein transkriptionelles Programm initiiert wird. Kürzlich konnte in murinen hämatopoetischen Vorläuferzellen gezeigt werden, dass nicht-phosphoryliertes STAT5B (uSTAT5B) ein ERG-induziertes Programm im Rahmen der megakaryozytären Differenzierung unterdrücken kann, also als transkriptioneller Repressor fungiert. Das Ziel dieser Arbeit war die Rolle von uSTAT5 im Rahmen der Erkrankung akute myeloische Leukämie (AML) sowie als therapeutische Zielstruktur zu untersuchen. ERGEBNISSE Wir konnten zeigen, dass STAT5A und -B in AML-Zellen sowohl in phosphorylierter als auch nicht-phosphorylierter Form vorliegt, und der Status der Phosphorylierung im Wesentlichen von der Co-Expression der mutierten Tyrosinkinase FLT3-ITD abhängt. Um die Bedeutung von uSTAT5 näher zu untersuchen, wurde die Expression von STAT5A oder -B mittels einer Doxyzyklin-induzierbaren shRNA supprimiert. Nach Knockdown von STAT5A und -B zeigte sich eine signifikante Reduktion der Proliferationsrate und insbesondere nach STAT5B-Knockdown die Aktivierung eines transkriptionellen Differenzierungsprogramms (Nachweis mittels RNA-Sequenzierung), gefolgt von der Expression von CD11b und morphologischen Veränderungen. Um den Mechanismus dieser Veränderungen zu untersuchen, wurden THP1, SKM1 und MV4-11 AML-Zellen in SILAC-Medium kultiviert und das Interaktom von STAT5A und -B mittels pull-down-Experimenten und nachfolgender Massenspektrometrie untersucht. Interessanterweise zeigten sich für uSTAT5A und uSTAT5B unterschiedliche Interaktionsprofile. Während uSTAT5A vor allem mit Proteinen der RNA-Prozessierung und Translation-Initiierung interagierte, war uSTAT5B überwiegend an Chromatin- und Histon-bindende Proteine, wie z.B. ETV6 oder KDM5C, gebunden. Um die Rolle von STAT5 in einem Leukämiemausmodell zu untersuchen, wurden Knochenmarkzellen einer Stat5fl/fl oder einer Stat5fl/fl_Mx1-Cre Maus mit dem Konstrukt MSCV_Mll/Af9_IRES-GFP infiziert und in lethal-bestrahlte Empfängertiere transplantiert. Nach Depletion von Stat5 ergab sich in sekundär transplantierten Mäusen eine signifikante verminderte Überlebenszeit im Vergleich zur Kontrollmäusen. Die genauere Untersuchung der Leukämiezellen zeigte eine zunehmende Ausreifung der Stat5-depletierten Tiere. Dieses Ergebnis weist auf ein Differenzierungssyndrom hin, wie es auch bei akuter Promyelozyten-Leukämie nach ATRA-Behandlung beobachtet wird und ist in Einklang mit der in Zelllinien beobachteter Differenzierung nach STAT5B-Knockdown. ZUSAMMENFASSUNG In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass neben phosphoryliertem STAT5 auch uSTAT5A und- B definierte biologische Funktionen regulieren. Insbesondere uSTAT5B scheint durch Modulation von epigenetischen Regulatoren die Differenzierung von AML-Zellen zu unterdrücken und repräsentiert einen neuen therapeutischen Ansatz in der Behandlung von AML-Patienten.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3029
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000026553
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	175 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen