Authors:	Braun, Simon
Title:	Decoding a cancer-relevant splicing decision in the RON proto-oncogene using high-throughput mutagenesis
Online publication date:	12-Feb-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Alternatives Spleißen stellt einen wichtigen Mechanismus der Genregulation dar, der die Kodierungskapazität des menschlichen Genoms drastisch erhöht. Aus Fehlern dieses Prozesses können verschiedene Krankheiten wie Krebs entstehen. Ermöglicht wird die Kontrolle des alternativen Spleißens durch die Rekrutierung transaktiver RNA bindender Proteine an cis-regulatorische Elemente. Obwohl zahlreiche dieser Interaktionen bereits im Detail beschrieben sind, ist der regulatorische Code, der der Spleiß-Entscheidung zu Grunde liegt, vielfach nicht verstanden. Hier wurde ein Hochdurchsatz-Zufallsmutagenese-Screening entwickelt, das die für einen Krebs-relevanten Spleißvorgang im Protoonkogen RON entscheidenden Mutation und RNA bindenden Proteine umfassend charakterisiert. Insgesamt wurden mehr als 700 Mutationen identifiziert, die die Regulation des alternativen Exons signifikant beeinflussen. Es wurde darüber hinaus gezeigt, dass die mit Hilfe des Screenings quantifizierten Mutationseffekte mit alternativem Spleißen von RON in Krebspatienten korrelieren. Zudem wurden zahlreiche transaktive Regulatoren enthüllt und das heterogene nukleäre Ribonucleoprotein H (HNRNPH) als extensiver Regulator des RON Spleißens in Zelllinien und Krebs identifiziert. Mittels iCLIP und Synergieanalyse zwischen Mutationen und HNRNPH Knock-down wurden die funktionell wichtigsten HNRNPH-Bindestellen in RON lokalisiert. Schließlich wurde aufgezeigt, dass kooperative HNRNPH-Bindung ein Umschalten des Spleißens von RON Exon 11 reguliert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Spleiß-Regulation durch nahezu jedes Nukleotid innerhalb des alternativen Exons vermittelt wird. Darüber hinaus weist die große Zahl an transaktiven Regulatoren darauf hin, dass ein komplexes Spleiß-Netzwerk an der Kontrolle des RON Spleißens beteiligt ist. Alternative splicing is an important regulatory mechanism of gene expression that dramatically increases the coding capacity of the human genome. Various diseases including cancer can arise from defects in this process. Control of alternative splicing is realized by cis-regulatory elements, which recruit trans-acting RNA-binding proteins. Although several of those interactions are already described in detail, the regulatory code that underlies specific splicing decisions is frequently not understood. Here, a high-throughput random mutagenesis screen was established that comprehensively characterized determinants of a cancer-relevant splicing event in the proto-oncogene RON. In total, more than 700 mutations were found to significantly affect the regulation of the alternative exon. It was moreover shown that mutation effects quantified from the screening correlate with RON alternative splicing in cancer patients. In addition, numerous trans-acting regulators were revealed and the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H (HNRNPH) was identified as an extensive regulator of RON splicing in cell lines and in cancer. iCLIP and analysis of synergy between mutations and HNRNPH knockdown allowed localization of the functionally most relevant HNRNPH binding sites across RON. Finally, cooperative HNRNPH binding was shown to mediate a splicing switch of RON exon 11. These results demonstrate that splicing regulation is conferred by nearly every nucleotide within the alternative exon. Furthermore, the large number of trans-acting regulators point to a complex splicing regulatory network involved in the control of RON splicing.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-3026
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000026270
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	ix, 125 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen