Decoding a cancer-relevant splicing decision in the RON proto-oncogene using high-throughput mutagenesis
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Alternatives Spleißen stellt einen wichtigen Mechanismus der Genregulation dar, der die Kodierungskapazität des menschlichen Genoms drastisch erhöht. Aus Fehlern dieses Prozesses können verschiedene Krankheiten wie Krebs entstehen. Ermöglicht wird die Kontrolle des alternativen Spleißens durch die Rekrutierung transaktiver RNA bindender Proteine an cis-regulatorische Elemente. Obwohl zahlreiche dieser Interaktionen bereits im Detail beschrieben sind, ist der regulatorische Code, der der Spleiß-Entscheidung zu Grunde liegt, vielfach nicht verstanden. Hier wurde ein Hochdurchsatz-Zufallsmutagenese-Screening entwickelt, das die für einen Krebs-relevanten Spleißvorgang im Protoonkogen RON entscheidenden Mutation und RNA bindenden Proteine umfassend charakterisiert. Insgesamt wurden mehr als 700 Mutationen identifiziert, die die Regulation des alternativen Exons signifikant beeinflussen. Es wurde darüber hinaus gezeigt, dass die mit Hilfe des Screenings quantifizierten Mutationseffekte mit alternativem Spleißen von RON in Krebspatienten korrelieren. Zudem wurden zahlreiche transaktive Regulatoren enthüllt und das heterogene nukleäre Ribonucleoprotein H (HNRNPH) als extensiver Regulator des RON Spleißens in Zelllinien und Krebs identifiziert. Mittels iCLIP und Synergieanalyse zwischen Mutationen und HNRNPH Knock-down wurden die funktionell wichtigsten HNRNPH-Bindestellen in RON lokalisiert. Schließlich wurde aufgezeigt, dass kooperative HNRNPH-Bindung ein Umschalten des Spleißens von RON Exon 11 reguliert. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass Spleiß-Regulation durch nahezu jedes Nukleotid innerhalb des alternativen Exons vermittelt wird. Darüber hinaus weist die große Zahl an transaktiven Regulatoren darauf hin, dass ein komplexes Spleiß-Netzwerk an der Kontrolle des RON Spleißens beteiligt ist.