Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-3024
Authors: Arnold, Sandra
Title: 3D-Elektronenmikroskopie und Ligandenbindung des dodekaedrischen Acetylcholin-Bindeproteins aus der Posthornschnecke Biomphalaria glabrata
Online publishing date: 9-Feb-2019
Language : german
Abstract: Die nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) sind ionotrope Rezeptoren, die als Bestandteil der Synapse an der Nervenerregungsübertragung beteiligt sind. Aufgrund ihrer biomedizinischen Relevanz sind sie ein wichtiger Forschungsgegenstand. Viele Untersuchungen wurden an den wasserlöslichen Acetylcholin- Bindeproteinen (AChBP) durchgeführt, welche strukturell und funktionelle Homologe aus der Hämolymphe verschiedener Mollusken und Anneliden sind. Das AChBP ist ein ringförmiges Pentamer mit fünf Ligandenbindungstaschen. Eine Besonderheit zeigt die Struktur des AChBP der Posthornschnecke Biomphalaria glabrata (BgAChBP), in dem es einen Dodekaeder aus zwölf Pentameren bildet. In der vorliegenden Arbeit sollten mittels Kryo-3D-Elektronenmikroskopie hochaufgelöste Rekonstruktionen des BgAChBP in Anwesenheit von Nikotin und ohne einen Liganden erstellt werden. Des Weiteren wurden mit den Methoden der Trp-Fluoreszenzmessung und des in silico-Dockings die Bindungseigenschaften der Liganden Nikotin, Acetylcholin, BisTris, GABA, Glycin mit der rekombinanten Isoform BgAChBP1 und der durch gerichtete Mutagenese erzeugten Mutante BgAChBP1-F92Y untersucht. Für das rekombinante BgAChBP1 in Anwesenheit des Liganden Nikotin wurde eine 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 4,6 Å erreicht. Die 3D-Rekonstruktion des BgAChBP1 in Abwesenheit eines Liganden erreichte dagegen eine Auflösung von 3,7 Å. Hier konnten neben den Sekundärstruktur auch einzelne sterisch anspruchsvolle Aminosäureseitenketten aufgelöst werden. So war es möglich, das Homologiemodell mittels flexiblem Fitting zu präzisieren. Für diese Arbeit konnte vermittels gerichteter Mutagenese die Mutante BgAChBP1-F92Y als funktionelles Protein erzeugt werden. Ein Vergleich der Bindungseigenschaften zeigte, dass die Mutante mit der Aminosäure Y92, sowohl Nikotin als auch Acetylcholin stärker bindet, als der Wildtyp mit der Aminosäure F92. Bei den anderen untersuchten Liganden konnte kein Unterschied beobachtet werden. Die Bindungseigenschaften all dieser Liganden wurden darüber hinaus in silico auf molekularer Ebene betrachtet. Insgesamt bilden die Ergebnisse dieser Arbeit ein solides Fundament für die weitere strukturelle und funktionelle Analyse des BgAChBP1-Dodekaeders.
Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) are ionotropic receptors that are involved in the transmission of nerve excitation as part of the synapse. Due to their biomedical relevance, nAChR are a highly active field of research. In the literature, there are significant numbers of research papers on the water-soluble acetylcholine binding proteins (AChBP), which are structural and functional homologues from the haemolymph of various molluscs and annelids. AChBP is a ring-shaped pentamer with five ligand binding pockets. A unique feature of the AChBP structure of the tropical freshwater snail Biomphalaria glabrata is that they form a dodecahedron of twelve pentamers. In the research presented here, high-resolution reconstructions of the BgAChBP with and without the ligand nicotine were constructed using cryo-3D electron microscopy. Furthermore, the binding properties of the ligands nicotine, acetylcholine, BisTris, GABA, glycine with the recombinant isoform BgAChBP1 and the mutant BgAChBP1-F92Y produced by directional mutagenesis were investigated using the methods of Tryptophan fluorescence measurement and in silico docking. For the recombinant BgAChBP1 in the presence of the ligand nicotine, a 3D reconstruction with a resolution of 4,6 Å was achieved. While the 3D reconstruction of BgAChBP1 in the absence of a ligand achieved a resolution of 3,7 Å. In addition to the secondary structure, individual sterically demanding amino acid side chains could also be resolved. Thus, it was possible to specify the homology model more precisely by means of a flexible fitting. For this work, the mutant BgAChBP1-F92Y could be generated as a functional protein by means of directed mutagenesis. A comparison of the binding properties showed that the mutant with the amino acid Y92 binds both nicotine and acetylcholine more strongly than the wild type with the amino acid F92. No difference could be observed in the other ligands investigated. The binding properties of all these ligands were also considered in silico at the molecular level. Overall, the results of this work form a solid foundation for further structural and functional analysis of the BgAChBP1 dodecahedron.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-3024
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: i, 128 Seiten
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