3D-Elektronenmikroskopie und Ligandenbindung des dodekaedrischen Acetylcholin-Bindeproteins aus der Posthornschnecke Biomphalaria glabrata
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Die nikotinischen Acetylcholin-Rezeptoren (nAChR) sind ionotrope Rezeptoren, die als Bestandteil der Synapse an der Nervenerregungsübertragung beteiligt sind. Aufgrund ihrer biomedizinischen Relevanz sind sie ein wichtiger Forschungsgegenstand. Viele Untersuchungen wurden an den wasserlöslichen Acetylcholin- Bindeproteinen (AChBP) durchgeführt, welche strukturell und funktionelle Homologe aus der Hämolymphe verschiedener Mollusken und Anneliden sind. Das AChBP ist ein ringförmiges Pentamer mit fünf Ligandenbindungstaschen. Eine Besonderheit zeigt die Struktur des AChBP der Posthornschnecke Biomphalaria glabrata (BgAChBP), in dem es einen Dodekaeder aus zwölf Pentameren bildet. In der vorliegenden Arbeit sollten mittels Kryo-3D-Elektronenmikroskopie hochaufgelöste Rekonstruktionen des BgAChBP in Anwesenheit von Nikotin und ohne einen Liganden erstellt werden. Des Weiteren wurden mit den Methoden der Trp-Fluoreszenzmessung und des in silico-Dockings die Bindungseigenschaften der Liganden Nikotin, Acetylcholin, BisTris, GABA, Glycin mit der rekombinanten Isoform BgAChBP1 und der durch gerichtete Mutagenese erzeugten Mutante BgAChBP1-F92Y untersucht.
Für das rekombinante BgAChBP1 in Anwesenheit des Liganden Nikotin wurde eine 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 4,6 Å erreicht. Die 3D-Rekonstruktion des BgAChBP1 in Abwesenheit eines Liganden erreichte dagegen eine Auflösung von 3,7 Å. Hier konnten neben den Sekundärstruktur auch einzelne sterisch anspruchsvolle Aminosäureseitenketten aufgelöst werden. So war es möglich, das Homologiemodell mittels flexiblem Fitting zu präzisieren. Für diese Arbeit konnte vermittels gerichteter Mutagenese die Mutante BgAChBP1-F92Y als funktionelles Protein erzeugt werden. Ein Vergleich der Bindungseigenschaften zeigte, dass die Mutante mit der Aminosäure Y92, sowohl Nikotin als auch Acetylcholin stärker bindet, als der Wildtyp mit der Aminosäure F92. Bei den anderen untersuchten Liganden konnte kein Unterschied beobachtet werden. Die Bindungseigenschaften all dieser Liganden wurden darüber hinaus in silico auf molekularer Ebene betrachtet. Insgesamt bilden die Ergebnisse dieser Arbeit ein solides Fundament für die weitere strukturelle und funktionelle Analyse des BgAChBP1-Dodekaeders.