Authors:	Wagner, Knut
Title:	Development of a comprehensive on-line multidimensional high performance column liquid chromatography system for protein and peptide mapping with integrated size selective sample fractionation
Online publication date:	1-Jan-2001
Year of first publication:	2001
Language:	english
Abstract:	Aufbau einer kontinuierlichen, mehrdimensionalen Hochleistungs-flüssigchromatographie-Anlage für die Trennung von Proteinen und Peptiden mit integrierter größenselektiver ProbenfraktionierungEs wurde eine mehrdimensionale HPLC-Trennmethode für Proteine und Peptide mit einem Molekulargewicht von <15 kDa entwickelt.Im ersten Schritt werden die Zielanalyte von höhermolekularen sowie nicht ionischen Bestandteilen mit Hilfe von 'Restricted Access Materialien' (RAM) mit Ionenaustauscher-Funktionalität getrennt. Anschließend werden die Proteine auf einer analytischen Ionenaustauscher-Säule sowie auf Reversed-Phase-Säulen getrennt. Zur Vermeidung von Probenverlusten wurde ein kontinuierlich arbeitendes, voll automatisiertes System auf Basis unterschiedlicher Trenngeschwindigkeiten und vier parallelen RP-Säulen aufgebaut.Es werden jeweils zwei RP-Säulen gleichzeitig, jedoch mit zeitlich versetztem Beginn eluiert, um durch flache Gradienten ausreichende Trennleistungen zu erhalten. Während die dritte Säule regeneriert wird, erfolgt das Beladen der vierte Säule durch Anreicherung der Proteine und Peptide am Säulenkopf. Während der Gesamtanalysenzeit von 96 Minuten werden in Intervallen von 4 Minuten Fraktionen aus der 1. Dimension auf die RP-Säulen überführt und innerhalb von 8 Minuten getrennt, wobei 24 RP-Chromatogramme resultieren.Als Testsubstanzen wurden u.a. Standardproteine, Proteine und Peptide aus humanem Hämofiltrat sowie aus Lungenfibroblast-Zellkulturüberständen eingesetzt. Weiterhin wurden Fraktionen gesammelt und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie untersucht. Bei einer Injektion wurden in den 24 RP-Chromatogrammen mehr als 1000 Peaks aufgelöst. Der theoretische Wert der Peakkapazität liegt bei ungefähr 3000. Development of a comprehensive on-line multidimensional high performance column liquid chromatography system for protein and peptide mapping with integrated size selective sample fractionationA multidimensional HPLC-system with integrated size selective sample fractionation was developed for the analysis of proteins and peptides with a molecular weight < 15 kDa. First, the low molecular weight target analytes were separated from high molecular weight and non ionic components (matrix) using novel silica based restricted access materials (RAM) with ion exchange functionality.This is followed by the separation applying ion-exchange and reversed-phase chromatography. In order to avoid losses by off-line sample handling, a fully automated on-line coupled column system was developed using different separation speeds in either dimension and four parallel RP-columns.Two RP-columns were eluted simultaneously but with postponed gradient beginnings in order to achieve high resolution separations applying shallow gradients. The third column was regenerated while the fourth column was loaded by enriching the proteins and peptides on the column head (on column focusing). Within the total analysis time of 96 min 24 fractions of 4 minutes duration were transferred from the first dimension to the RP-columns and were separated within an analysis time of 8 minutes. The system was applied to samples of human hemofiltrate as well as of cell lysates originating from a human fetal fibroblast cell-line as test and reference substances. Selected peaks were collected and analysed off-line by MALDI-TOF mass spectrometry. The automated on-line system resolved more than 1000 peaks. The theoretical peak capacity can be calculated to be as high as 3000.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2959
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-2373
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen