Authors:	Fabrizius, Andrej
Title:	Untersuchungen zur Lokalisation und Expression des respiratorischen Proteins Neuroglobin bei Säugetieren
Online publication date:	11-Nov-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	In der vorliegenden Arbeit wurde Neuroglobin (Ngb), ein evolutiv altes und in Metazoen konserviertes respiratorisches Protein, funktionell untersucht. Mittels des induzierbaren Tet on / Tet off Systems wurde Ngb ektopisch in der murinen Leber und im Gehirn überexprimiert. Die Transkriptome von Leber und Gehirnregionen Ngb-transgener Mäuse wurden mittels Microarrays und RNA-Seq im Vergleich zum Wildtyp analysiert, um Auswirkungen der Ngb-Überexpression zu ermitteln. Die Transkriptom-Analyse in Leber und Gehirn zeigte eine nur geringe Anzahl differenziell regulierter Gene und Stoffwechselwege nach Ngb-Überexpression. Ngb transgene Mäuse wurden CCl4-induziertem ROS-Stress ausgesetzt und die Leberfunktion untersucht. Zudem wurden primäre Hepatozyten-Kulturen etabliert und in diesen in vitro die extrinsische Apoptose induziert. Die Stressversuche zeigten: (i) Die Ngb-Überexpression hat keine protektive Wirkung in der Leber in vivo. (ii) In Leberzellen in vitro hingegen verminderte eine Ngb-Überexpression effizient die Aktivierung der apoptotischen Kaskade. Eine protektive Wirkung von Ngb ist vermutlich von betrachtetem Gewebe und dem verwendeten Stressor abhängig und keine generelle, selektierte Funktion des Proteins.rnWeiterhin wurde eine Ngb-KnockOut-Mauslinie mit einem LacZ-KnockIn-Genotyp etabliert. Hierbei zeigten die KO-Mäuse keinen offensichtlichen Phänotyp in ihrer Entwicklung, Fortpflanzung und Retina-Funktion. Unter Verwendung des LacZ-Knockin-Konstrukts konnten kontrovers diskutierte Ngb-Expressionsorte im adulten Mausgehirn (Hippocampus, Cortex und Cerebellum) sowie in Testes experimentell bestätigt werden. Parallel wurden öffentlich verfügbare RNA-Seq Datensätze ausgewertet, um die regionale Ngb-Expression systematisch ohne Antikörper-assoziierte Spezifitätsprobleme zu charakterisieren. Eine basale Ngb-Expression (RPKM: ~1-5) wurde im Hippocampus, Cortex und Cerebellum, sowie in Retina und Testes ermittelt. Eine 20-40fach höhere, starke Expression (RPKM: ~160) wurde im Hypothalamus bzw. im Hirnstamm nachgewiesen. Die â digitaleâ Expressionsuntersuchung wurde mittels qRT-PCR und Western Blot bestätigt. Dieses Expressionsprofil von Ngb in der Maus weist auf eine besondere funktionelle Bedeutung von Ngb im Hypothalamus hin. Eine Funktion von Ngb in der Sauerstoffversorgung der Retina und eine generelle Funktion von Ngb in der Protektion von Neuronen sind mit dem beobachteten Expressionsspektrum weniger gut vereinbar. In this thesis the function of the metazoan, evolutionary old respiratory protein neuroglobin (Ngb) was analyzed. Using the inducible Tet-on / Tet-off System Ngb was ectopically expressed in murine liver and brain tissues. Ngb-overexpressing transcriptomes of neuronal and hepatic tissues were analyzed to describe the effect of Ngb-overexpression on these tissues compared to wild type. The analysis revealed no formerly in association with Ngb discussed pathways as dysregulated. Ngb-transgenic mice were stressed in vivo with the hepatotoxic CCl4 and the liver-function was assessed. Primary hepatocyte-cultures of Ngb-overexpressing tissues were established and the extrinsic apoptotic pathway was induced in vitro to assess the protective effects of Ngb on liver tissue. The stress regimes showed no protection of the Ngb-expression in vivo from CCl4-induced ROS-damage but an efficient protection through Ngb from activating the extrinsic apoptotic pathway compared to wild type hepatocytes. The reported protective effect of Ngb probably depends on the used stress-regimes and tissues and is not an evolutionary conserved and selected function of Ngb. Furthermore an Ngb-KnockOut and LacZ-KnockIn mouse lines based on the EUCOMM-KnockOut-First-Vector were established. The development, reproduction and retinal function in Ngb-KO mice were analyzed and showed no obvious phenotype. Utilizing the LacZ-reporter mice controversially discussed Ngb expression-sites in the murine brain (hippocampus, cortex and cerebellum) were verified. Analyzing publicly available data the Ngb-expression was re-evaluated using RNA-Seq technique. Here hypothalamus was identified as the main Ngb expression-site in the murine CNS, with a 100x higher expression compared to other regions like cortex, hippocampus, cerebellum and retina a published high Ngb expression-site. This â digitalâ Ngb-expression was verified using wet lab methods like qRT-PCR and western blot. This new expression profile of Ngb with quantitative differences in the CNS argues with an evolutionary conserved protective function of Ngb and instead hints on different functions of Ngb in low expressing and high expressing cells.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2917
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-38930
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	138 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen