Authors:	Barea Roldán, Diana
Title:	Functional characterization of the placenta specific protein PLAC1 and its use for cancer immunotherapy
Online publication date:	23-Oct-2014
Year of first publication:	2014
Language:	english
Abstract:	Summary Antibody-based cancer therapies have been successfully introduced into the clinic and have emerged as the most promising therapeutics in oncology. The limiting factor regarding the development of therapeutical antibody vaccines is the identification of tumor-associated antigens. PLAC1, the placenta-specific protein 1, was categorized for the first time by the group of Prof. Sahin as such a tumor-specific antigen. Within this work PLAC1 was characterized using a variety of biochemical methods. The protein expression profile, the cellular localization, the conformational state and especially the interacting partners of PLAC1 and its functionality in cancer were analyzed. Analysis of the protein expression profile of PLAC1 in normal human tissue confirms the published RT-PCR data. Except for placenta no PLAC1 expression was detectable in any other normal human tissue. Beyond, an increased PLAC1 expression was detected in several cancer cell lines derived of trophoblastic, breast and pancreatic lineage emphasizing its properties as tumor-specific antigen. rnThe cellular localization of PLAC1 revealed that PLAC1 contains a functional signal peptide which conducts the propeptide to the endoplasmic reticulum (ER) and results in the secretion of PLAC1 by the secretory pathway. Although PLAC1 did not exhibit a distinct transmembrane domain, no unbound protein was detectable in the cell culture supernatant of overexpressing cells. But by selective isolation of different cellular compartments PLAC1 was clearly enriched within the membrane fraction. Using size exclusion chromatography PLAC1 was characterized as a highly aggregating protein that forms a network of high molecular multimers, consisting of a mixture of non-covalent as well as covalent interactions. Those interactions were formed by PLAC1 with itself and probably other cellular components and proteins. Consequently, PLAC1 localize outside the cell, where it is associated to the membrane forming a stable extracellular coat-like structure.rnThe first mechanistic hint how PLAC1 promote cancer cell proliferation was achieved identifying the fibroblast growth factor FGF7 as a specific interacting partner of PLAC1. Moreover, it was clearly shown that PLAC1 as well as FGF7 bind to heparin, a glycosaminoglycan of the ECM that is also involved in FGF-signaling. The participation of PLAC1 within this pathway was approved after co-localizing PLAC1, FGF7 and the FGF7 specific receptor (FGFR2IIIb) and identifying the formation of a trimeric complex (PLAC1, FGF7 and the specific receptor FGFR2IIIb). Especially this trimeric complex revealed the role of PLAC1. Binding of PLAC1 together with FGF7 leads to the activation of the intracellular tyrosine kinase of the FGFR2IIIb-receptor and mediate the direct phosphorylation of the AKT-kinase. In the absence of PLAC1, no FGF7 mediated phosphorylation of AKT was observed. Consequently the function of PLAC1 was clarified: PLAC1 acts as a co-factor by stimulating proliferation by of the FGF7-FGFR2 signaling pathway.rnAll together, these novel biochemical findings underline that the placenta specific protein PLAC1 could be a new target for cancer immunotherapy, especially considering its potential applicability for antibody therapy in tumor patients. Zusammenfassung Antikörper-basierte Krebstherapien gehören zu den vielversprechendsten Therapieformen in der Onkologie. Der limitierende Faktor für die Entwicklung therapeutischer Antikörper-Impfstoffe ist die Identifizierung Tumor-assoziierter Antigene. PLAC1, Plazenta-spezifisches Protein 1, wurde erstmals in der Gruppe von Prof. Sahin als solch ein tumorspezifisches Antigen kategorisiert.Im Rahmen dieser Arbeit wurde PLAC1 anhand einer Vielzahl von biochemischen Methoden charakterisiert. Das Protein- Expressionsprofil, die zelluläre Lokalisation, die strukturelle Konformation des Proteins in der Zelle und vor allem das Interaktionsnetzwerk von PLAC1 sowie dessen Funktion wurden analysiert.Die Analyse des Protein-Expressionsprofil von PLAC1 auf menschlichen Gewebeproben und menschlichen Krebszelllinien zeigt eindeutig, dass die PLAC1 Expression ausschließlich auf Plazenta beschränkt ist. Darüber hinaus wurde eine erhöhte PLAC1 Expression in Trophoblasten-, Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs abstammen Krebszelllinien detektiert, was wiederum die Kategorisierung als tumorspezifisches Antigen bestätigt. Analysen bestätigten, dass PLAC1 ein funktionelle Signalpeptid (SP) enthält. Dieses Signalpeptid ist für die Sezernierung von PLAC1 via ER (endoplasmatisches Retikulum) und den sekretorischen Weg verantwortlich. Obgleich PLAC1 keine Transmembrandomäne aufweist, konnte kein ungebundenes Protein im Zellkulturüberstand überexprimierender Zellen nachgewiesen werden. Jedoch konnte PLAC1 nach Isolierung verschiedenster zellulärer Kompartimente eindeutig in der Membranfraktion angereichert werden. Mittels Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration) konnte PLAC1 als aggregierendes Protein charakterisiert werden, welches ein Netzwerk hochmolekularer Multimere bildet. Diese PLAC1-Multimere bestehen aus einer Mischung nicht-kovalenter als auch kovalenter Wechselwirkungen von PLAC1 Monomeren und vermutlich auch anderer zellulärer Komponenten und Proteinen. Folglich lokalisieren PLAC1 außerhalb der Zelle, wo es an die Membran unter Bildung eines stabilen extrazellulären Struktur zugeordnet ist.Wie PLAC1 die Proliferation von Krebszellen zu fördern scheint, wurde durch die Identifizierung des Fibroblasten-Wachstumsfaktor FGF7 als spezifischen Interaktionspartner von PLAC1 aufgeklärt. Es konnte nachgewiesen werden, dass PLAC1 ebenso wie FGF7 an Heparin bindet, welches ebenso wie FGF7 auch an der FGF-Signalkaskade beteiligt ist. Die Beteiligung von PLAC1 an dieser Signalkaskade wurde letztlich durch die Co-Lokalisation von PLAC1, FGF7 und die FGF7 spezifischen Rezeptor (FGFR2IIIb) sowie die Bildung eines trimeren Komplex (PLAC1, FGF7 und der spezifische Rezeptor FGFR2IIIb) bestätigt. Speziell anhand des trimeren Komplexes konnte die Rolle von PLAC1 zeigte werden. Die Bindung von PLAC1 zusammen mit FGF7 an den FGF-Rezeptor führt zu dessen Aktivierung und vermittelt die direkte Phosphorylierung der AKT-Kinase. In Abwesenheit von PLAC1 wurde keine FGF7 vermittelte Phosphorylierung von AKT beobachtet. Demnach konnte die molekulare Rolle von PLAC1 bezüglich der zellulären Prozesse geklärt werden: PLAC1 fungiert als Co-Faktor des FGF7-FGFR2 induzierten Signalwegs, welcher unter anderem für die Regulation des zellulären Wachstums verantwortlich ist. rnInsgesamt unterstreichen diese neuartigen biochemischen Erkenntnisse, dass das Plazenta-spezifische Protein PLAC1 ein fantastisches neues Zielantigen für die Krebs-Therapie ist, insbesondere angesichts dessen potentiellen Anwendbarkeit für die Antikörper-Therapie bei Tumorpatienten.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2905
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-38791
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	101 S.
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