Authors:	Schönbühler, Bianca
Title:	Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz
Online publication date:	28-Aug-2014
Year of first publication:	2014
Language:	german
Abstract:	Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn An efficient protein quality control is essential for cell viability. Molecular chaperones sustain the dynamic balance between protein folding and degradation. On the other hand, chaperone function is modulated by the interaction with a plethora of cochaperones. The cochaperone and ubiquitin ligase CHIP is a central factor in Proteintriage decisions, as it targets chaperone substrates for degradation and therefore links the folding machinery directly to protein turnover systems. To prevent premature degradation of client substrates, the destructive activity of CHIP is regulated by other cochaperones.rnIn this work, the inhibition of the ubiquitin ligase activity of CHIP by the cochaperone BAG2 was shown mechanistically for the first time in a cellular system, employing the human IMR-90 fibroblast cell line and HSP72 as a model CHIP substrate. By reducing the ubiquitination and therefore the degradation of HSP72, BAG2 regulated steady state levels of HSP72 without modulation of the heat shock response. Under conditions of applied heat stress, increased BAG2 levels had a negative effect on the progression of the heat shock response and on cell viability. Thus, stabilized HSP72 protein levels reduced the stress resistance of the cell, probably because BAG2 impaired the balance between substrate folding and degradation tremendously by inhibiting CHIP mediated ubiquitination.rnAs the mechanisms of protein quality control adapt to the changing conditions during aging, potential alterations of CHIP activity and regulation by BAG2 in cellular aging were analyzed in a second part of this work using IMR90 fibroblasts as a model of replicative senescence. In senescent cells the HSP72 ubiquitination status was diminished compared to young fibroblasts which suggested a reduced CHIP activity. Overexpressed BAG2 further lowered HSP72 ubiquitination in aged cells. Therefore, the potential of BAG2 to modulate CHIP activity still persisted during cellular aging. Furthermore, BAG2 regulated the protein levels of the CHIP substrate and senescence regulator p53 in senescent fibroblasts which implied a possible involvement of BAG2 in the establishment of the senescence phenotype. Interestingly, the protein levels of the two functional redundant CHIP-modulators BAG2 and HSPBP1 were regulated reciprocally during cellular aging. This opposing regulation also occurred in the lungs of old mice. Moreover, BAG2 protein levels were elevated significantly in the aged hippocampus.rnTaken together, the results confirm the function of BAG2 as an inhibitor of the ubiquitin ligase CHIP. Furthermore, regulation of CHIP activity undergoes an age-dependent adaptation process which might be relevant to preserve the proteostasis of aged cells and in which BAG2 as a CHIP-modulator might play an important role.rnFuture studies may further reveal the complex mechanisms of CHIP regulation. This may contribute to antagonize the age-dependent decline in proteostatic control and to prevent aberrant protein aggregation in age-related diseases.rn
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2869
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-38296
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	125 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen