Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2827
Authors: Wagner, Meike
Title: Molecular and functional characterization of the candidate tumor antigens placenta specific 1 and claudin 6
Online publication date: 31-Jan-2016
Year of first publication: 2016
Language: english
Abstract: Identification of tumor-specific antigens is central to the effectiveness of cancer immunotherapies. Within this study, two candidate tumor antigens, placenta-specific 1 (PLAC1) and claudin 6 (CLDN6), were characterized regarding their suitability to serve as antigens for cancer immunotherapeutic approaches. PLAC1 is a tumor-specific antigen with tumor-promoting functions in breast cancer. The estradiol (E2)-responsive PLAC1 gene is known to be regulated by estrogen receptor α (ERα), specificity protein 1 (SP1) and CCAAT/enhancer binding protein β-2 (C/EBPβ-2). However, additional regulators of PLAC1 were not identified so far. Here, it was investigated whether members of the nuclear receptor co-activator (NCOA)/p160 family are involved in ERα/E2-mediated trans-activation of PLAC1 in breast cancer. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP), NCOA3 was identified to be selectively recruited to the PLAC1 promoter upon E2-stimulation only in ERα-positive MCF-7 breast cancer cells but not in ERα-negative SK-BR-3 cells. RNAi-mediated silencing of NCOA3 revealed diminished PLAC1 mRNA and protein levels in MCF-7 but not in SK-BR-3 cells. Stimulation of MCF-7 cells with E2 resulted in decreased up-regulation of PLAC1 compared to control transfected cells. Moreover, a significant correlation of PLAC1 and NCOA3 expression was found in ERα-positive human breast cancer tissues only. Collectively, these data show that PLAC1 is a downstream target of NCOA3 and provides a relationship between NCOA3 and PLAC1 that could be important for future immunotherapies targeting hormone-responsive breast cancer. The tight junction molecule CLDN6 is an embryonic antigen that plays a major role during epithelial differentiation. In this study, expression, function and regulation of CLDN6 in cancer was characterized. Analysis of CLDN6 expression by quantitative real-time RT-PCR showed that CLDN6 is absent in adult normal tissues but frequently overexpressed in many cancers, especially in ovarian, testicular and lung cancer. RNAi-mediated silencing of CLDN6 did not reveal any function for CLDN6 in proliferation, apoptosis, cell cycle, migration and adhesion in three different cancer cell lines. However, colony formation was decreased in CLDN6-negative compared to CLDN6-positive PA-1 teratocarcinoma cells. The capacity to form colonies at distant sites is a key feature of tumor cells with tumor-initiating potential suggesting a role for CLDN6 in cancer stem cells (CSC). This was further supported by the significant correlation of CLDN6 expression with several CSC-specific markers in ovarian cancer detected in this study. Moreover, CLDN6 was found here to be specifically detected on the surface of induced pluripotent (iPS) cells and up-regulated throughout the course of reprogramming. Thus, CLDN6 could be confirmed as a specific marker for iPS cells. Bisulfite sequencing and methylation-specific qPCR (MsqPCR) revealed that CLDN6 expression in tumors is associated with promoter hypomethylation. However, it is likely that promoter demethylation is not sufficient for up-regulation of CLDN6 in cancer. Accordingly, promoter analysis using deletion constructs, ChIP and RNAi-mediated silencing suggests that CCCTC-binding factor (CTCF) and brother of regulator of imprinted sites (BORIS) are possible transcription factors regulating CLDN6 in cancer. In summary, this work introduces CLDN6 as highly specific tumor antigen with a possible role in CSC that could be used for cancer immunotherapy in particular to target CSC.
Die Identifizierung tumorspezifischer Antigene ist das Herzstück in der Entwicklung effektiver Krebsimmuntherapien. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Kandidaten-Antigene, placenta-specific 1 (PLAC1) und claudin 6 (CLDN6), in Hinblick auf ihre potentielle Verwendung in der Krebsimmuntherapie analysiert. PLAC1 ist ein tumorspezifisches Antigen mit tumorfördernden Funktionen in Brustkrebs. Das östradiol (E2)-responsive PLAC1 wird durch estrogen receptor α (ERα), specificity protein 1 (SP1) und CCAAT/enhancer binding protein β-2 (C/EBPβ-2) reguliert. Weitere Regulatoren von PLAC1 wurden bisher nicht identifiziert. Daher wurde in dieser Arbeit untersucht, ob Mitglieder der nuclear receptor co-activator (NCOA)/p160 Familie in der ERα/E2-vermittelten Trans-Aktivierung von PLAC1 in Brustkrebs involviert sind. Mittels Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) wurde herausgefunden, dass NCOA3 nach E2-Stimulation selektiv an den Promoter von PLAC1 in ERα-positiven MCF-7 jedoch nicht in ERα-negativen SK-BR-3 Brustkrebszellen rekrutiert wird. Der RNAi-vermittelte knock down von NCOA3 führte wiederum nur in MCF-7, nicht in SK-BR-3 Zellen zu vermindertet Expression von PLAC1 und weitere Stimulation von MCF-7 Zellen mit E2 führte zu einer verminderten Hochregulation von PLAC1 im Vergleich zu den Kontrollzellen. Darüber hinaus wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Expression von PLAC1 und der Überexpression von NCOA3 nur in ERα-positiven humanen Brustkrebsproben entdeckt. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass PLAC1 ein Zielgen von NCOA3 ist. Der Zusammenhang zwischen NCOA3 und PLAC1 könnte von Relevanz für zukünftige immuntherapeutische Ansätze zur Bekämpfung von hormon-responsivem Brustkrebs sein. Das tight-junction Molekül CLDN6 ist ein embryonales Antigen, das eine wichtige Rolle in der epithelialen Differenzierung spielt. In dieser Arbeit wurde die Expression, Funktion und Regulation von CLDN6 in Krebs charakterisiert. Mittels quantitativer real-time RT-PCR wurde gezeigt, dass CLDN6 in adulten Normalgeweben nicht exprimiert ist, jedoch in verschiedenen Krebsarten, besonders Ovarial-, Hoden- und Lungenkrebs überexprimiert ist. Durch RNAi-vermittelten knock down von CLDN6 in drei verschiedenen Tumorzelllinien konnte keine Funktion für CLDN6 in Proliferation, Zellzyklus, Apoptose, Adhäsion oder Migration gefunden werden. Jedoch wurde eine verminderte Koloniebildung von CLDN6-negativen im Vergleich zu CLDN6-positiven PA-1 Teratokarzinomzellen gefunden. Die Fähigkeit zur Koloniebildung ist eine Haupteigenschaft von Tumorzellen mit tumor-initiierendem Potential. Dies deutet auf eine Rolle von CLDN6 in Krebsstammzellen hin, was durch die signifikante Korrelation von CLDN6 mit verschiedenen Krebsstammzellmarkern in Ovarialtumorgeweben gestützt wird. Darüber hinaus konnte CLDN6 als spezifischer Marker für humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) identifiziert werden, da CLDN6 spezifisch auf der Oberfläche von iPS Zellen exprimiert ist und im Verlauf der Reprogrammierung hochreguliert wird. Mittels Bisulfit-Sequenzierung und methylierungs-spezifischer qPCR konnte gezeigt werden, dass die Expression von CLDN6 in Tumoren mit einer Hypomethylierung des Promoters einhergeht. Diese reicht aber nicht aus, um die Expression von CLDN6 im Tumor zu aktivieren. Promoteranalysen mittels Deletionkonstrukten und ChIP sowie RNAi-Experimente konnten zeigen, dass CCCTC-binding factor (CTCF) und brother of regulator of imprinted sites (BORIS) an der Regulation von CLDN6 in Krebs beteiligt sind. Zusammenfassend wird in dieser Arbeit gezeigt, dass CLDN6 ein hochspezifisches Tumorantigen mit einer möglichen Rolle in Krebsstammzellen ist. Es stellt daher ein vielversprechendes Zielmolekül für die Krebsimmuntherapie dar, insbesondere bei Ansätzen, die gegen Krebsstammzellen gerichtet sind.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2827
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000001390
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 134 Blätter
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