Authors:	Twelkmeyer, Trix
Title:	Phagozyten in der murinen Leishmaniasis - Charakterisierung der zellspezifischen Unterschiede des Leishmania major enthaltenden Kompartiments in Makrophagen und dendritischen Zellen
Online publication date:	3-Feb-2019
Year of first publication:	2019
Language:	german
Abstract:	Im Säugetierwirt liegt der heteroxene Parasit Leishmania major hauptsächlich in den residenten Makrophagen (MF) und dendritischen Zellen (DC) der Haut vor. Diese ontogenetisch eng verwandten myeloiden Zellen gehören zu den aktivsten Phagozyten, sind zur Antigenpräsentation fähig, unterscheiden sich aber drastisch in der Reaktion auf eine Infektion und das intrazelluläre Schicksal von Leishmania. MF werden zunächst ohne Entzündungsreaktion invadiert und bieten ideale Bedingungen für die parasitäre Transformation und Replikation. Die Aufnahme in DC hingegen führt zur Aktivierung, Migration und Initiierung der T Zell vermittelten Immunität. Dennoch sind es letztlich aktivierte MF die durch Nitritoxid die intrazelluläre Elimination und damit die Resolution der Infektion auslösen. Diese Phagozyten sind somit der Schlüssel für den Übergang vom progressiven Krankheitsverlauf hin zur immunologischen Kontrolle und der damit verbundenen lebenslangen Gedächtnisantwort. In vivo Studien in Abwesenheit von Phagozyten leisten einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung pathologischer Mechanismen, bisher sind diese in der Leishmaniasis jedoch auf die selektive Depletion verschiedener DC Subtypen und PMN beschränkt. Zielstellung des ersten Teils der Arbeit war daher die selektive Depletion von MF im experimentellen Modell der kutanen Leishmaniasis. Zunächst wurde Diphtherietoxin an Mäuse verabreicht, die einen sensitiven Rezeptor unter Kontrolle des Lysozym-M Promotors exprimieren. Als zweites System wurden Clodronat Liposomen eingesetzt. Bei wirkungsvoller MF Depletion reduzierte sich das Überleben der Mäuse auf wenige Tage. Erfolgte die Applikation seltener, konnte keine Reduktion erzielt werden und das Infektionsresultat war vergleichbar mit den Kontrollbe- handlungen. Resultierend war daher eine Bewertung der Funktion von MF in der Infektion mit L. major mittels dieser Systeme nicht möglich. Darüber hinaus könnten die Unterschiede zwischen MF und DC durch die Internalisierung, die intrazelluläre Prädestination und die molekulare Zusammensetzung der parasitophoren Vakuolen (PV) bedingt sein. Der zweite Teil der Arbeit vergleicht daher das Auftreten und die Lokalisation phagosomaler Reifungsmarker nach der Aufnahme von L. major und Latex Beads in repräsentative MF und DC Zelllinien. Gesamtzellulär zeigte die DC Linie (SP37A3) eine längere Präsenz von Lamp2 nach der Internalisierung von Amastigoten. Lokalisiert in der PV Membran hingegen wurden Regulationen weder in Abhängigkeit vom internalisierten Partikel noch vom Zelltyp offensichtlich. Zusätzlich wurde die intrazelluläre Prädestination adressiert, die Signalintensität des Proliferationsfarbstoffes wies sowohl in primären MF als auch in J774A.1 auf eine Replikation beider L. major Lebensformen hin. In primären DC und SP37A3 hingegen konnte dies nur für Amastigote gezeigt werden. Die weitere Analyse des BrdU ermittelten Hoechst Quenching kombiniert mit einer Vitalitätsfärbung konnte zudem zwischen Transformation und DNA-Replikation von Leishmanien in J774A.1 differenzieren. Letztlich ist die Analyse des Proteoms der intrazellulären Nische ein idealer Ansatz Informationen über Prozesse sowohl in L. major als auch in der invadierten Zelle zu erhalten. Im letzten Teil der Arbeit wurde demzufolge eine durchflusszytometrische Methode zur Isolation von PV etabliert. Die MF und DC Linien wurden mit Amastigoten koinkubiert, anschließend fixiert und mechanisch lysiert. Die PV wurden aus dem Zelllysat durch fluoreszenzaktivierte Sortierung gewonnen, basierend auf dem Ausschluss von Debris und intakten Zellen in Kombination mit einer positiven Se- lektion in Bezug auf den Proliferationsfarbstoff. Erste massenspektrometrische Analysen zeigten asymmetrische Verhältnisse in den Abundanzen von parasitären und Wirtsproteinen. Diese zu reduzieren war Ziel der anschließend implementierten proliferationsunabhängigen Markierung von Amastigoten und der indirekten Markierung der PV Membran. Die ausstehenden Bestimmungen müssen die Integrität der erhaltenen Isolate bestätigen, damit dieser Ansatz zum Verständnis der Pathomechanismen beitragen und zur Identifizierung möglicher Impfstoffe verwendet werden kann.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2824
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000025898
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XV, 124 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen