Authors:	Sutandy, Reymond
Title:	Deciphering the binding regulation of the core splicing factor U2AF65 using in vitro iCLIP
Online publication date:	22-Jan-2019
Year of first publication:	2019
Language:	english
Abstract:	Durch Bildung unterschiedlicher reifer mRNAs aus einzelnen Genen erhöht alternatives Spleißen die proteomische Vielfalt in Eukaryonten. RNA-Protein Interaktionen organisieren die Regulation des alternativen Spleißens in einem mehrstufigen Prozess, der die Regulation der Bindung des essentiellen Spleiß-Faktors U2AF65 im Rahmen der Definition der 3‘ Spleißstelle umfasst. Zur Untersuchung der U2AF65-Bindung und deren Regulation durch andere RNA bindende Proteine (RBP) haben wir ‘in vitro iCLIP’ entwickelt, das ermöglicht RNA-Protein Interaktionen im definierten System zu erfassen. Mit Hilfe von rekombinanten Proteinen und einer Reihe von in vitro Transkripten wurde in vitro iCLIP zur Transkriptweiten Messung von U2AF65 Bindungsaffinitäten verwendet. Auf den Affinitätsdaten basierende Mathematische Modellierung ermöglichte den Vergleich der in vitro und in vivo U2AF65 Bindungs-Muster und verschaffte uns umfangreiche Informationen über die Transkript-weite in vivo Regulation der Bindung. Wir haben herausgefunden, dass U2AF65 Bindung umfassend reguliert ist, einschließlich der Stabilisierung von U2AF65 an 3‘ Spleißstellen und Entfernung des Proteins von intronischen Regionen. Darüber hinaus wurde auf RBP Sequenzmotiven basiertes, maschinelles Lernen verwendet um RBP zu identifizieren, die die U2AF65 Bindung an regulierten Bindestellen potentiell modulieren. Dadurch haben wir eine Handvoll bekannter und neuer Interaktoren der U2AF65 Bindung identifiziert. Zusätzliche in vitro Validierung offenbarte, dass hnRNPC, PTBP1 und PCBP1 hauptsächlich als Binde-Suppressoren in Erscheinung treten, während FUBP1 und CELF6 die Bindung von U2AF65 verstärken. Knock-down Experimente dieser RBP deuteten darauf hin, dass die in vitro Modulierung der U2AF65 Bindung durch diese RBP den Ausgang des alternativen Spleißens in vivo beeinflusst. Zusammenfassend betrachtet liefert in vitro iCLIP eine Plattform, welche die Charakterisierung von RNA-Protein Interaktionen im vereinfachten System ermöglicht und zur Unterstützung der Interpretation komplexer in vivo Binde-Daten genutzt werden kann. Alternative splicing increases proteome diversity in eukaryotes by generating different variants of mature mRNA from single genes. RNA-protein interactions orchestrate the regulation of alternative splicing in a multi-step manner, including binding modulation of the core-splicing factor U2AF65 in 3’ splice site definition. To study U2AF65 binding and its modulation by other RNA binding proteins (RBPs), we developed ‘in vitro iCLIP’ that enables capturing RNA-protein interactions in a defined system. By using recombinant proteins and a set of in vitro transcripts, we applied in vitro iCLIP to measure U2AF65 binding site affinities in a transcript-wide manner. Mathematical modeling based on the affinity data allowed comparison of the in vitro and in vivo U2AF65 binding landscapes, and provided us with comprehensive information on the transcript-wide in vivo binding regulation. We found that U2AF65 binding is extensively regulated, including stabilization at 3’ splice sites and clearance of binding in intronic regions. Furthermore, a machine learning approach based on RBP sequence motifs was used to identify RBPs that potentially modulate U2AF65 binding at the differentially regulated sites. As a result, we identified a handful of known and novel regulators of U2AF65 binding. Further in vitro validation revealed that hnRNPC, PTBP1, and PCBP1 mainly act as suppressors, whereas FUBP1 and CELF6 enhance U2AF65 binding. Knockdown experiments of the RBPs indicated that in vitro U2AF65 binding modulations by these RBPs affect the alternative splicing outcome in vivo. In conclusion, in vitro iCLIP provides a platform that allows characterization of RNA-protein interactions in a simplified system and can be used to aid in the interpretation of complex in vivo binding data.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	Externe Einrichtungen
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2817
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000025554
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	93 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen