Deciphering the binding regulation of the core splicing factor U2AF65 using in vitro iCLIP
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Durch Bildung unterschiedlicher reifer mRNAs aus einzelnen Genen erhöht alternatives Spleißen die proteomische Vielfalt in Eukaryonten. RNA-Protein Interaktionen organisieren die Regulation des alternativen Spleißens in einem mehrstufigen Prozess, der die Regulation der Bindung des essentiellen Spleiß-Faktors U2AF65 im Rahmen der Definition der 3‘ Spleißstelle umfasst. Zur Untersuchung der U2AF65-Bindung und deren Regulation durch andere RNA bindende Proteine (RBP) haben wir ‘in vitro iCLIP’ entwickelt, das ermöglicht RNA-Protein Interaktionen im definierten System zu erfassen. Mit Hilfe von rekombinanten Proteinen und einer Reihe von in vitro Transkripten wurde in vitro iCLIP zur Transkriptweiten Messung von U2AF65 Bindungsaffinitäten verwendet. Auf den Affinitätsdaten basierende Mathematische Modellierung ermöglichte den Vergleich der in vitro und in vivo U2AF65 Bindungs-Muster und verschaffte uns umfangreiche Informationen über die Transkript-weite in vivo Regulation der Bindung. Wir haben herausgefunden, dass U2AF65 Bindung umfassend reguliert ist, einschließlich der Stabilisierung von U2AF65 an 3‘ Spleißstellen und Entfernung des Proteins von intronischen Regionen. Darüber hinaus wurde auf RBP Sequenzmotiven basiertes, maschinelles Lernen verwendet um RBP zu identifizieren, die die U2AF65 Bindung an regulierten Bindestellen potentiell modulieren. Dadurch haben wir eine Handvoll bekannter und neuer Interaktoren der U2AF65 Bindung identifiziert. Zusätzliche in vitro Validierung offenbarte, dass hnRNPC, PTBP1 und PCBP1 hauptsächlich als Binde-Suppressoren in Erscheinung treten, während FUBP1 und CELF6 die Bindung von U2AF65 verstärken. Knock-down Experimente dieser RBP deuteten darauf hin, dass die in vitro Modulierung der U2AF65 Bindung durch diese RBP den Ausgang des alternativen Spleißens in vivo beeinflusst. Zusammenfassend betrachtet liefert in vitro iCLIP eine Plattform, welche die Charakterisierung von RNA-Protein Interaktionen im vereinfachten System ermöglicht und zur Unterstützung der Interpretation komplexer in vivo Binde-Daten genutzt werden kann.