Authors:	Weber, Iuliia
Title:	Modulating the glycolytic or Wnt-beta-catenin signaling pathway to generate EBV-specific human CD8+ cytotoxic T lymphocytes with stem cell memory and central memory properties (EBV-CTLSCM/CM)
Online publication date:	6-Feb-2017
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	Die transplantationsassoziierte lymphoproliferative Erkrankung ist eine ernste und lebensbedrohliche Krankheit, die durch das Epstein Barr Virus (EBV) in immunsupprimierten Patienten nach der hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSZT) verursacht wird. Hochdosis-Chemotherapie oder Ganzkörperbestrahlung verursachen eine massive Beeinträchtigung des Immunsystems von HSZT-Patienten und erhöhen das Risiko von opportunistischen und rezidivierenden Infektionen. Die in vitro Generierung und ein adoptiver Zelltransfer von EBV-spezifischen zytotoxischen CD8+ T Lymphozyten, die „stem cell memory“ (EBV-CTLSCM) und „central memory“ (EBV-CTLCM) Eigenschaften aufweisen, stellen eine interessante Möglichkeit dar, um die antivirale Immunität zu verbessern. Ein großer Vorteil dieser Zellen ist ihre verlängerte Lebensdauer und erhöhte Selbsterneuerung im Vergleich zu „effector memory T cells“ und Effektor-T-Zellen (TEFF). Das Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene Methoden zur in vitro Generierung von antigen-spezifischen „stem cell memory“ (TSCM)- und „central memory“ (TCM)- ähnlichen T-Zellen zu untersuchen. Dafür wurden naive CD45RA+ CD8+ T-Zellen aus „peripheral blood mononuclear cells“ (PBMC) von gesunden Probanden isoliert und wöchentlich mit EBV-spezifischen Peptiden in der Anwesenheit von Rapamycin, 2-Deoxy-Glukose (2-DG) oder TWS119 stimuliert. Es wurde nachgewiesen, dass alle drei Inhibitoren in der Lage sind die Differenzierung der T-Zellen zu regulieren, wodurch diese vorwiegend CD45RA, CD95, CD62L und CCR7 exprimieren, was auf den Phänotyp der TSCM- und TCM- ähnlichen T-Zellen hindeutet. Allerdings zeigen unsere Untersuchungen, dass Rapamycin unter anderem sehr stark das Zellwachstum und die Antigenspezifität der behandelten T-Zellen inhibiert hat. Aus diesem Grund wurden keine weiteren Versuche mit Rapamycin behandelten T-Zellen durchgeführt. Stoffwechsel-Analysen zeigten, dass 2-DG und TWS119 behandelte naive CD8+ T Zellen (EBV-CTLSCM/CM Zellen) einen TSCM- und TCM- ähnlichen “quiescent“ Stoffwechsel aufweisen, wobei die Energie im Form von ATP vorwiegend durch die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) gewonnen wird. Zusätzlich exprimierten EBV-CTLSCM/CM Zellen die „homing“ Marker CCR7 und CD62L und wiesen dadurch eine erhöhte Migrationskapazität im Vergleich zu TEFF Zellen auf. In der Anwesenheit von EBV-infizierten B Zellen (B-LCLs) konnten 2-DG behandelte EBV-CTLSCM/CM Zellen in vitro IFN-ɣ sezernieren. Allerdings konnte die zytotoxische Aktivität gegen die B-LCLs in einem „chromium release assay“ nicht bestätigt werden. Im Gegensatz dazu zeigten die TWS119 behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen nicht nur eine sehr gute IFN-ɣ Produktion in vitro sondern auch eine viel höhere Zytotoxizität (40%) gegen B-LCLs. Um das Langzeitüberleben von 2-DG behandelten EBV-spezifischen CTLSCM/CM Zellen in Abwesenheit des Antigens (B-LCL) zu testen, wurden diese in NOD/SCID-IL2Rcγnull (NSG)-Mäuse unter Zugabe von ILR13-Fc (IL15 mit erhöhter Halbwertszeit) transferiert. Nach 14 Tagen konnten nur 1.8% von 2-DG behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen in peripherem Blut dieser Mäuse detektiert werden, was auf eine verminderte Überlebensdauer dieser Zellen in vivo hinweist. Nach dem adoptiven Zelltransfer von EBV-spezifischen CTLSCM/CM Zellen in NOD/SCID-IL2Rcγnull (NSG)-Mäuse, welche mit MHC-angepassten B-LCLs transplantiert wurden, konnte man ebenfalls nur sehr geringe Mengen von 2-DG behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen detektieren. Das Tumorwachstum in Kontroll-Mäusen und in Mäusen, die mit T Zellen transfundiert wurden, war vergleichbar. Folglich konnten die 2-DG behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen keine anti-tumorale Antwort gegen B-LCL induzieren. Im Gegensatz zu 2-DG behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen wiesen TWS119 behandelte EBV-CTLSCM/CM Zellen eine verbesserte Überlebensdauer in Abwesenheit von B-LCL auf. Dementsprechend wurden 30% der TWS119 behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen in der Milz und im Blut der am Tag 28 geopferten Mäuse detektiert. Außerdem zeigten TWS119 behandelte EBV-CTLSCM/CM Zellen eine Anti-Lymphom Aktivität wodurch B-LCL transplantierte Mäuse, die mit TWS119 behandelten EBV-CTLSCM/CM Zellen innerhalb des adoptiven Zelltransfers transfundiert wurden, eine Überlebensrate bis zu 80 Tage aufwiesen. Trotz allem wurde in den untersuchten Mäusen eine geringe Anzahl von Tumorzellen detektiert, was darauf hinweist, dass TWS119 behandelte EBV-CTLSCM/CM Zellen das Tumorwachstum kontrollieren, jedoch keine Tumor-Regression induzieren können. Zusammenfassend waren naive CD45RA+ CD8+ T-Zellen, die mit TWS119 behandelt wurden, weit funktionaler und effizienter als T-Zellen, die mit Rapamycin oder 2-DG behandelt wurden. In vitro generierte CTLSCM/CM Zellen stellen einen vielversprechenden Ansatz zur Vorbeugung von opportunistischen viralen Infektionen in immunsupprimierten Patienten nach einer HSZT dar. Post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD) is a serious and life threatening disease driven by Epstein Barr Virus (EBV) in immunocompromised patients undergoing hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). High dose chemotherapy or whole-body irradiation treatment severely impairs the immune system and increases the risk of opportunistic and recurrent infections, particularly caused by persistent viruses of the herpesvirus family such as cytomegalovirus (CMV) and EBV (Gottschalk et al. 2005). Currently, donor-derived memory virus-specific T cells are applied as antiviral treatment. However, the in vitro generation and adoptive transfer of EBV-specific CD8 cytotoxic T lymphocytes (CTL) displaying stem cell memory (EBV-CTLSCM) and central memory (EBV-CTLCM) characteristics might be an interesting option to improve antiviral immunity since CTLSCM/CM cells have been shown to have a prolonged long-lifespan and increased self-renewal capacity as compared to effector memory and effector T cells (Cieri et al. 2012); (Biasco et al. 2015). Moreover, EBV-specific memory T cells might be an attractive tool to generate genetically modified TSCM or TCM cells such as e.g. CD19-CAR modified TSCM or TCM cells as reported by Sabatino and colleagues (Sabatino et al. 2016). Therefore, the aim of this proof of concept study was to explore different approaches to generate antigen specific TSCM- and TCM- like T cells in vitro. Naïve CD45RA CD8 T cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy donors were repetitively stimulated with EBV-specific peptides while pharmacologically treated with rapamycin, 2-deoxy glucose (2-DG) or TWS119. All drugs were shown to modulate T cell differentiation resulting in T cells that preferentially express the markers CD45RA, CD95, CD62L and CCR7 reported to define T lymphocytes with stem cell memory and central memory-like properties (He, Kato, Jiang, Daniel R Wahl, et al. 2011); (Sukumar et al. 2013); (Gattinoni et al. 2009). Accordingly, treatment with all three drugs resulted in the expression of TSCM- and TCM- like phenotype. However, our studies revealed that rapamycin also strongly inhibited cell proliferation and antigen specificity, and therefore its further application was discontinued. Results from metabolic assays demonstrated that both 2-DG and TWS119 treated naïve CD8 T cells (EBV-CTLSCM/CM cells) exhibited a TSCM- and TCM- like quiescent metabolism by mainly utilizing oxidative phosphorylation (OXPHOS) to generate ATP. In addition, EBV-CTLSCM/CM cells preferentially expressed the homing markers CCR7 and CD62L and showed increased migration capacity when compared to TEFF. 2-DG treated EBV-CTLSCM/CM cells were capable of secreting IFN-γ in vitro in the presence of EBV infected B cells (B-LCL) but unfortunately failed to elicit cytolytic activity to the same targets when tested in chromium-51 release assays. In contrast, TWS119 treated EBV-CTLSCM/CM cells showed superior IFN-γ production in vitro and 40% cytotoxicity towards B-LCL in chromium-51 release assay. To test for their long-term survival in the absence of antigen EBV-reactive CTLSCM/CM cells were transferred into NOD/SCID-IL2Rcγnull (NSG)-mice and supplemented with human ILR13-Fc (IL-15 with extended half-life). Small amounts of 2-DG treated EBV-CTLSCM/CM cells (1.8 %) could be detected in the peripheral blood of these mice at two weeks after transfer, suggesting that 2-DG treated EBV-CTLSCM/CM cells failed to survive and persist for an extended time period in vivo in the absence of antigen, although NSG mice might not provide optimal conditions for long-term survival due to an impaired immunological micromilieu. Finally, in vivo studies demonstrated that upon adoptive transfer of EBV-reactive CTLSCM/CM cells into NOD/SCID-IL2Rcγnull (NSG)-mice engrafted with MHC-matched, EBV-immortalized human B cells (B-LCL) very poor survival of 2-DG treated EBV-CTLSCM/CM cells could be detected, even though, the antigen (B-LCL) was present in the system. Tumor progression was equally rapid in control mice and in mice, who had received T cells. Thus, 2-DG treated EBV-CTLSCM/CM cells failed to induce an anti-tumor response towards B cell lymphoma. In contrast, TWS119 treated EBV-CTLSCM/CM cells showed better long-term survival as about 30% of TWS119 treated CTLSCM/CM cells could be detected in spleen and blood of mice sacrificed on day 28. Moreover, TWS119 treated EBV-CTLSCM/CM cells elicited a profound anti-lymphoma response and tumor mice that had received TWS119 EBV-CTLSCM/CM cells could be shown to survive for up to 80 days. As we detected small amounts of tumor in individual sacrificed recipients these results suggest, that TWS119 treated EBV-CTLSCM/CM cells controlled tumor growth but apparently were not able to confer complete tumor regression. In conclusion, treating naive CD45RA CD8 T cells with TWS119 was more successful as compared to rapamycin and 2-DG. EBV-specific CTLSCM/CM cells generated under the impact of TWS119 showed a TSCM- and TCM- like phenotype, increased migration capacity and quiescent metabolism in vitro. Moreover, CTLSCM/CM cells showed superior in vitro and in vivo antigen recognition and long-term survival in NSG-mice in absence of the antigen. In the future, in vitro generated CTLSCM/CM cells might be an interesting approach to prevent opportunistic and recurrent viral infection in immunosuppressed patients after HSCT. Furthermore, as viral-specific CTLSCM/CM cells can be transduced with genetically modified TCR (Cieri et al. 2012) or chimeric-antigen receptor (CAR) (Sabatino et al. 2016), these T cells could serve as a valuable tool to improve adoptive cellular immunotherapy.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2803
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000009881
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	vi, 100 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen