Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2749
Authors: Zidan, Mohamed
Title: Lentivirus-mediated knockdown of Galectin-10 and Foxp3 in human immune cells
Online publication date: 22-Jul-2013
Language: english
Abstract: Die Suppression von autoreaktiven T-Zellen ist eine Funktion von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs). CD4+CD25+ Tregs unterdrücken autoaggressive Immunantworten. Galectin-10 und Foxp3 sind wichtige Proteine, die an dem supprimierenden Mechanismus der Tregs beteiligt sind. Galectin-10 ist eines der ältesten bekannten humanen Proteine, die nicht in anderen Spezies gefunden worden sind. Foxp3 ist ein Transkriptionsfaktor, der in menschlichen CD4+CD25+ Tregs und in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen nach Aktivierung exprimiert wird. Ein siRNA-vermittelter Knockdown dieses intrazellulären löslichen Proteins hebt die supprimierende Funktion der humanen CD4+CD25+ Tregs auf.\r\nDiese Arbeit beinhaltet in vitro durchgeführte Untersuchungen zur Ermöglichung eines Knockdown von Galectin-10 und/oder Foxp3 in humanisierten Mäusen. Es war möglich, ein Verfahren für die Produktion von lentiviralen Partikeln zu etablierten, die sich als effizientes Vehikel für den Gentransfer in humane Stammzellen und verschiedene Tumor- und Immunzellen erwiesen. Nach der Transduktion von AML14.3D10 Tumorzellen mit GFP-codierenden lentiviralen Partikeln konnte eine langfristige Expression von GFP erreicht werden. Außerdem war es möglich lentivirale Partikel zu erzeugen, die mit shRNA gegen Galectin-10 codiert waren. Die erzeugten Partikel erwiesen sich als funktionell, indem sie eine deutliche Herunterregulation von Galectin-10 in konstitutiv Galectin-10 exprimierenden AML14.3D10 Tumorzellen bewirkten. Unsere Studie präsentierte außerdem eine erstmalige Untersuchung zum Nachweis von Galectin-10-Protein in Eosinophilen aus humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen (HSC). Diese stabile in vitro Galectin-10-Expression bietet ein alternatives Untersuchungsmodell zu CD4+CD25+ Tregs, die nicht aus CD34+ HSC differenziert werden können. Der zusätzliche Einbau des GFP-Gens in die mit shRNA gegen Galectin-10 codierende lentivirale Partikel war ein wichtiger Schritt zur Markierung von Zellen, die einen Galectin-10-Knockdown aufwiesen. Die neuen bicistronischen lentiviralen Partikel erwiesen sich sowohl in aus CD34+ HSC differenzierten Eosinophilen als auch in AML14.3D10 Zellen, die einen eosinophilen Phänotyp aufweisen, als funktionell. Schließlich konnte mit den bicistronischen lentiviralen Partikeln, die mit GFP und shRNA gegen Foxp3 codiert waren, eine Herunterregulation von Foxp3 in CD4+CD25- T-Effektor-Zellen erreicht werden, was erneut die erfolgreiche Herstellung von funktionellen lentiviralen Partikeln bewies.\r\n
The maintenance of tolerance to self is a function of CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Tregs). CD4+CD25+ Tregs suppress inadequate and autoaggressive immune responses. Galectin-10 and Foxp3 are important proteins that participate in suppressive mechanisms of Tregs. Galectin-10 is one of the oldest known human-specific proteins which is not found in any other species. Foxp3 is a transcription factor expressed in human CD4+CD25+ Tregs and in activated CD4+CD25- T effector cells. siRNA-mediated knockdown of this intracellular soluble protein abolishes the suppressive function of human CD4+CD25+ Tregs. \r\nThis work presents in vitro investigations carried out preceding the risky endeavour to knockdown galectin-10 and/or Foxp3 in humanized mice. It was possible to establish the procedures for production of lentiviral particles, which proved to be an efficient vehicle for gene transfer into human stem cells and different tumor and immune cells. This result was indicated by long term expression of GFP in AML14.3D10 tumor cells transduced by lentiviral particles encoding GFP. Moreover, it was possible to generate lentiviral particles encoding shRNA against galectin-10. The generated particles were shown to be functional and knocked down galectin-10 in AML14.3D10 cells which constitutively express galectin-10. Our study presented a premier investigation for detection of galectin-10 on protein level in eosinophils differentiated from human CD34+ hematopoietic stem cells (HSC). Significance of this stable galectin-10 expression in vitro evoked from being an accessible alternative for the impossible in vitro differentiation of CD4+CD25+ Tregs from CD34+ HSC. Incorporation of GFP gene within the lentiviral particles encoding shRNA against galectin-10 was a crucial step in order to mark the cells displaying galectin-10 knockdown. The novel bicistronic lentiviral particles turned out to be functional in both eosinophils differentiated from CD34+ HSC and AML14.3D10 cells which exhibit an advanced eosinophilic phenotype. Finally, utilizing bicistronic lentiviral particles encoding GFP and shRNA against Foxp3, it was possible to knock down Foxp3 in CD4+CD25- T effector cells referring to the production of functional lentiviral particles.\r\n
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2749
URN: urn:nbn:de:hebis:77-34786
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 104 S.
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