Authors:	Casper, Ingrid
Title:	Analysen zur Expression proinflammatorischer Mediatoren in humanen Zellkulturmodellen und murinen Tiermodellen chronisch-inflammatorischer Erkrankungen
Online publication date:	16-Jul-2013
Year of first publication:	2013
Language:	german
Abstract:	Die humane induzierbare NO-Synthase (iNOS) spielt bei zahlreichen Erkrankungen wie Asthma, Krebs und der rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Fehlregulation der iNOS-Expression kommt es häufig zu massiven Gewebeschädigungen. Aus diesem Grund ist es wichtig die Mechanismen der Genregulation der iNOS-Expression zu verstehen. Bei Affinitätschromatographie-Analysen wurde das zytosolische PolyA-bindende Protein (PABP) als direkter Interaktionspartner der 3´UTR der humanen iNOS identifiziert. Weitere Bindungsanalysen konnten eine spezifische Bindestelle für PABP in der 5´UTR und zwei Bindestellen im AU-reichen Bereich der 3´UTR der humanen iNOS nachweisen. Eine siRNA-mediierte Herabregulation von PABP mit Hilfe der stabilen Expression spezifischer siRNAs in DLD-1 Zellen (siPABP Zellen) zeigte eine signifikant verringerte Expression der humanen iNOS und damit einhergehend eine verringerte NO-Produktion nach Zytokinstimulation. Promotoranalysen zeigten keine Veränderung der Induzierbarkeit des humanen 16 kb iNOS-Promotors in siPABP Zellen. RNA-Stabilitätsanalysen zeigten einen verstärkten Abbau der iNOS-mRNA in diesen Zellen, so dass davon auszugehen ist, dass die Regulation der humanen iNOS über die mRNA-Stabilität erfolgt. Reportergen-Analysen mit Plasmiden, welche die 5â und/oder 3â UTR Sequenzen der humanen iNOS mit den identifizierten PABP-Bindestellen oder Mutationen in diesen Bindestellen enthielten, zeigten, dass PABP die iNOS-mRNA über die 5´UTR stabilisiert und anscheinend über die 3´UTR einen destabilisierenden Effekt auf die mRNA ausübt. Ebenfalls scheint PABP über die 3â UTR dieTranslation der iNOS mRNA zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass PABP, über seine allgemeinen Funktionen hinaus, eine spezifische Rolle in der Regulation der Expression der humanen iNOS einnimmt.\r\nDie rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche Autoimmunerkrankung, welche überwiegend die peripheren Gelenke der Hände und Füße betrifft. Die aktuellen Therapiemöglichkeiten sind immer noch mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet und führen nicht zur vollständigen Remission der Erkrankung, so dass die Entwicklung neuer Medikamente unerlässlich ist. In dieser Arbeit wurden die antiinflammatorischen Substanzen Gallielalacton (Gal) und Oxacyclododecindion (Oxa) im Mausmodell der kollagen-induzierten Arthritis (CIA) getestet. Leider waren beide Substanzen nicht in der Lage die Symptome der CIA zu vermindern, obwohl beide im Modell der LPS-induzierten akuten Entzündung die Expression proinflammatorischer Mediatoren senken konnten. Die Substanz S-Curvularin (SC) hat sich im CIA-Modell bereits bewährt und wurde in dieser Arbeit weiter untersucht. SC war in der Lage die Expression knorpel- und knochendestruktiver Markergene signifikant zu verrindern. \r\nIn der vorliegenden Arbeit wurden neue microRNAs identifiziert, die in der Pathogenese der CIA eine Dysregulation zeigen. Die Expression dieser microRNAs wurde von SC wieder auf das Normalniveau gebracht, so dass SC eine vielversprechende Substanz in der Therapie chronisch inflammatorische Erkrangungen sein könnte. Die neu identifizierten CIA-relevanten microRNAs könnten als neueRA-Marker oder als Zielstrukturen für neue Medikamente dienen.\r\n The human inducible nitric oxide synthase (iNOS) plays an important role in multiple human diseases like asthma, tumor development, and rheumatoide arthritis. An abberant regulation of iNOS-expression leads to a massive tissue destruction. Therefore it is important to understand the mechanisms of iNOS-regulation. Affinity purification using the 3´UTR of the human iNOS mRNA identified the cytosolic poly(A)-binding protein (PABP) as a direct interacting partner of the human iNOS 3´UTR. Further binding-analyses revealed a specific binding site of PABP in the 5´UTR and two binding sites in the AU-rich sequence of the 3´UTR. Downregulation of PABP expression by RNA interference (siPABP cells) resulted in a marked reduction of cytokine-induced iNOS mRNA expression and thereby in a reduction of iNOS-mediated NO-production. Reporter gene analyses showed no change of the inducibility of the human 16 kb iNOS promoter in siPABP cells. In contrast, the degradation of iNOS-mRNA was accelerated in siPABP cells. These results indicate a regulation of iNOS expression on mRNA-stability level. Reporter gene analyses with plasmids containing the PABP binding sites and mutations of these binding sites showed a stabilizing effect of PABP on iNOS-mRNA by binding to the 5´UTR. But PABP seems to have a destabilizing effect by binding to the 3´UTR on mRNA level as well as on translational level. These findings show that PABP, beside its normal functions, takes an important and specific role in the regulation of human iNOS expression.\r\nRheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory autoimmune disease predominantly affecting the periphereal joints of hands and feet. Recent therapies are afflicted with lots of severe side effects and cannot lead to remission. Therefore the development of new antiinflammatory drugs is essential. In this work the antiinflammatory compounds Gallielalactone (Gal) and Oxacyclododecindion (Oxa) were tested in the mouse model of collagen induced arthritis (CIA). Unfortunately neither Gal nor Oxa had the ability to reduce the symptoms of CIA although both were able to reduce inflammatory marker genes in a mouse modell of LPS-induced acute inflammation. The antiinflammatory compound S-Curvularin (SC) was able to reduce CIA-symptoms in earlier work and was further examined in this work. SC decreased the expression of markergenes involved in bone and cartilage destructionlikely by reducing osteoclast proliferation. \r\nThree microRNAs were newly identified to be dysregulated in the pathogenesis of CIA. SC was found to normalize the expression of these microRNAs back to the value of control mice. Therefore SC may serve as a promising structure for the development of new therapeutics for the treatment of chronic inflammatory diseases like RA. Further the newly identified microRNAs may be used as RA-marker or as targets for new therapeutic options.\r\n
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2747
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-34769
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	131 S.
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