Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2736
Authors: Brendel, Alexander
Title: Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration
Online publication date: 9-Jul-2013
Year of first publication: 2013
Language: german
Abstract: Calcium (Ca2+) ist ein ubiquitär vorkommendes Signalmolekül, das an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher müssen die intrazellulären Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziierten Neurodegeneration können dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erhöhte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erhöhten Vulnerabilität, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erhöhte Ca2+-Last zurückzuführen sein könnte, da diese Neuronen einem ständigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollständig aufgeklärt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden primäre Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rnâ Cameleon cpYC 3.6â (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abhängigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zelluläre Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erhöhten zytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, während keine signifikanten Veränderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abhängig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abhängige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Darüber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen Überleben.rnVeränderungen der Ca2+-Homöostase wurden auch während der normalen Alterung inrnprimären Fibroblasten und bei Mäusen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten Mäusen (C57B/6) detektiert.rnDer zelluläre Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeinträchtigt, was das neuronale Überleben beeinflussen kann. In zukünftige Studien soll aufgeklärt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen führen bzw. ob durch eine PMCA2-Überexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden können.
Numerous physiological and molecular events are calcium (Ca2+)-dependent and ageassociated alterations of Ca2+-homeostasis impair neuronal survival. Thus, increased [Ca2+]i accompanied by decreased survival in aged hippocampal neurons was described (Hajieva et al., 2009a). Moreover, it is assumed that Ca2+-dependent pacemaking by L-Type voltage gated Ca2+-channels could contribute to the selective degeneration of dopaminergic neurons occurring in Parkinson´s Disease (Chan et al., 2007). Since the underlying molecular mechanisms are not fully elucidated we have explored alterations of Ca2+-rnhomeostasis during age-associated neurodegeneration. Employing SH-SY5Y cells and primary mesencephalic neurons, we here demonstrate a significant increase in cytosolic calcium after inhibition of mitochondrial complex I by 1-methyl-4-phenylpyridine (MPP+), which is a well-established in vitro model of Parkinson- disease. This increase in calcium concentration is correlated with a downregulation of the neuron-specific plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2 (PMCA2). Two other important mediators of calcium efflux, sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), and Na+-Ca2+-exchanger (NCX), remained unaltered, indicating a specific role of PMCA2 in maintaining calcium homeostasis in midbrain neurons. The observed PMCA2 downregulation was accompanied by reduced levels of CREB phosphorylation dependent on protein kinase A (PKA). Interestingly, MPP+ induced PMCA2 downregulation andrnelevated cytosolic Ca2+ could be prevented by activating PKA. In order to investigate the potential influence of PMCA2 on neuronal vulnerability,rnexperimental downregulation of PMCA2 by means of siRNA was performed. The results demonstrate a significant impairment of cell survival under conditions of PMCA2 suppression. Hence, increased cytosolic calcium levels as a consequence of insufficient calcium efflux lead to an increased vulnerability of midbrain neurons. In order to investigate the PMCA2 efflux system during normal brain aging we analyzed the brain tissue from young (3 months) and old (24 months) mice Results show a significant decrease of PMCA2 in naturally aged animals. Furthermore, we have used an in vitro model of replikative senescence (IMR90 fibroblasts), where age dependent decrease in different PMCA isoforms could also be detected. Further studies will be needed to clarify the exact molecular mechanism between PMCA2 decrease, elevation of intracellularrnCa2+ and neuronal vulnerability. Our findings point towards a dysregulation of calcium homeostasis in Parkinson- disease related neurodegeneration and suggest a specific molecular mechanism.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2736
URN: urn:nbn:de:hebis:77-34621
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 109 S.
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