Authors:	Singh, Vijay Kumar
Title:	Generation of FLT3-ITD-reactive T-cell populations from different sources
Online publication date:	21-May-2013
Year of first publication:	2013
Language:	english
Abstract:	Approximately 25% of acute myeloid leukemias (AMLs) carry internal tandem duplications (ITD) of various lengths within the gene encoding the FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3). Although varying duplication sites exist, most of these length mutations affect the protein´s juxtamembrane domain. FLT3-ITDs support leukemic transformation by constitutive phosphorylation resulting in uncontrolled activation, and their presence is associated with worse prognosis. As known form previous work, they represent leukemia- and patient-specific neoantigens that can be recognized by autologous AML-reactive CD8+ T cells (Graf et al., 2007; Graf et al., unpublished). Herein, in patient FL, diagnosed with FLT3-ITD+ AML and in first complete remission after induction chemotherapy, T cells against her leukemia´s individual FLT3-ITD were detected at a frequency up to 1.7x10-3 among peripheral blood CD8+ T lymphocytes. This rather high frequency suggested, that FLT3-ITD-reactive T cells had been expanded in vivo due to the induction of an anti-leukemia response.rnrnCell material from AML patients is limited, and the patients´ anti-leukemia T-cell repertoire might be skewed, e.g. due to complex previous leukemia-host interactions and chemotherapy. Therefore, allogeneic sources, i.e. buffy coats (BCs) from health donors and umbilical cord blood (UCB) donations, were exploited for the presence and the expansion of FLT3-ITD-reactive T-cell populations. BC- and UCB-derived CD8+ T cells, were distributed at 105 cells per well on microtiter plates and, were stimulated with antigen-presenting cells (APCs) transfected with in vitro-transcribed mRNA (IVT-mRNA) encoding selected FTL3-ITDs. APCs were autologous CD8- blood mononuclear cells, monocytes or FastDCs.rnrnBuffy coat lymphocytes from 19 healthy individuals were analyzed for CD8+ T-cell reactivity against three immunogenic FLT3-ITDs previously identified in patients VE, IN and QQ and designated as VE_, IN_ and QQ_FLT3-ITD, respectively. These healthy donors carried at least one of the HLA I alleles known to present an ITD-derived peptide from one of these FLT3-ITDs. Reactivities against single ITDs were observed in 8/19 donors. In 4 donors the frequencies of ITD-reactive T cells were determined and were estimated to be in the range of 1.25x10-6 to 2.83x10-7 CD8+ T cells. These frequencies were 1,000- to 10,000-fold lower than the frequency of autologous FLT3-ITD-reactive T cells observed in patient FL. Restricting HLA I molecules were identified in two donors. In one of them, the recognition of VE_FLT3-ITD was found to be restricted by HLA-C*07:02, which is different from the HLA allele restricting the anti-ITD T cells of patient VE. In another donor, the recognition of IN_FLT3- ITD was restricted by HLA-B*35:01, which also had been observed in patient IN (Graf et al., unpublished). By gradual 3´-fragmentation of the IN_FLT3-ITD cDNA, the 10-mer peptide CPSDNEYFYV was identified as the target of allogeneic T cells against IN_FLT3-ITD. rnLymphocytes in umbilical cord blood predominantly exhibit a naïve phenotype. Seven UCB donations were analyzed for T-cell responses against the FLT3-ITDs of patients VE, IN, QQ, JC and FL irrespective of their HLA phenotype. ITD-reactive responses against all stimulatory FLT3-ITDs were observed in 5/7 UCB donations. The frequencies of T cells against single FLT3-ITDs in CD8+ lymphocytes were estimated to be in the range of 1.8x10-5 to 3.6x10-6, which is nearly 15-fold higher than the frequencies observed in BCs. Restricting HLA I molecules were identified in 4 of these 5 positive UCB donations. They were mostly different from those observed in the respective patients. But in one UCB donation T cells against the JC_FLT3-ITD had exactly the same peptide specificity and HLA restriction as seen before in patient JC (Graf et al., 2007). Analyses of UCB responder lymphocytes led to the identification of the 10-mer peptide YESDNEYFYV, encoded by FL_FLT3-ITD, that was recognized in association with the frequent allele HLA-A*02:01. This peptide was able to stimulate and enrich ITD-reactive T cells from UCB lymphocytes in vitro. Peptide responders not only recognized the peptide, but also COS-7 cells co-transfected with FL_FLT3-ITD and HLA-A*02:01.rnrnIn conclusion, T cells against AML- and individual-specific FLT3-ITDs were successfully generated not only from patient-derived blood, but also from allogeneic sources. Thereby, ITD-reactive T cells were detected more readily and at higher frequencies in umbilical cord blood than in buffy coat lymphocytes. It occurred that peptide specificity and HLA restriction of allogeneic, ITD-reactive T cells were identical to autologous patient-derived T cells. As shown herein, allogeneic, FLT3-ITD-reactive T cells can be used for the identification of FLT3-ITD-encoded peptides, e.g. for future therapeutic vaccination studies. In addition, these T cells or their receptors can be applied to adoptive transfer. Bei etwa einem Viertel akuter myeloischer Leukämien (AML) lassen sich im Gen des FMS-like tyrosine kinase receptor 3 (FLT3) interne Tandemduplikationen (ITD) unterschiedlicher Länge nachweisen. Diese Längenmutationen treten meistens in der Juxtamembrandomäne auf. ITD führen zur konstitutiven Phosphorylierung und Aktivierung des Proteins. Ihre Präsenz ist mit schlechterer Prognose assoziiert. Sie repräsentieren Leukämie- und Patienten-spezifische Neoantigene, die von CD8+ T-Zellen auf AML-Zellen erkannt werden können (Graf et al., 2007; Graf et al., unveröffentlicht). Im Blut der AML-Patientin FL wurden in erster kompletter Remission nach Induktionschemotherapie CD8+ FLT3-ITD-reaktive Lymphozyten in einer Frequenz von 1,7×10-3 gefunden. Diese hohe Frequenz legte nahe, dass bei der Patientin infolge einer Leukämie-Wirt-Interaktion in vivo eine Expansion ITD-reaktiver T-Zellen induziert worden war.rnrnZellmaterial von AML-Patienten steht nur in begrenzter Menge zur Verfügung. Darüber hinaus ist anzunehmen, dass das AML-reaktive T-Zellrepertoire von Patienten durch komplexe Leukämie-Wirt-Interaktionen und durch Chemotherapie kompromittiert ist. Deshalb wurde untersucht, inwieweit FLT3-ITD-reaktive T-Zellen in buffy coat (BC)-Lymphozyten gesunder Spender und in Nabelschnurblut (umbilical cord blood, UCB) nachweisbar sind und daraus expandiert werden können. Zur In vitro-Stimulation wurden in Mikrotiterplatten CD8+ T-Zellen (105/Kultureinheit) gegen Antigen-präsentierende Zellen (APC) stimuliert, die mit in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) für verschiedene FLT3-ITD transfiziert waren. Als APC wurden autologe CD8- mononukleäre Blutzellen eingesetzt sowie daraus isolierte Monozyten und FastDC.rnrnIn BC von 19 gesunden Spendern wurde nach CD8+ T-Zellreaktivität gegen die immuno-genen FLT3-ITD der Patienten VE, IN und QQ gesucht, bezeichnet als VE_, IN_, bzw. QQ_FLT3-ITD. Die BC-Spender trugen mindestens eines der HLA I-Allele, von denen bekannt war, dass sie Peptide aus diesen FLT3-ITD präsentierten. Reaktivität gegen einzelne ITD wurde bei 8/19 Spendern beobachtet. Bei vier Spendern wurden die Frequenzen ITD-reaktiver T-Zellen in CD8+ Lymphozyten ermittelt. Sie lagen in einem Bereich von 1,25x10-6 bis 2,83x10-7 und damit etwa 3-4 Größenordnungen unter der Frequenz ITD-reaktiver T-Zellen bei der Patientin FL. Bei zwei BC-Spendern wurden restringierende HLA-Allele identifiziert, nämlich HLA-C*07:02 für VE_FLT3-ITD und HLA-B*35:01 für IN_FLT3-ITD. Während die ITD-reaktiven T-Zellen des Patienten VE durch ein anderes HLA-Molekül restringiert waren, war HLA-B*35:01 auch Restriktionsmolekül der ITD-reaktiven T-Zellen des Patienten IN ( Graf et al., unveröffentlicht). Durch 3´-Fragmentierung der IN_FLT3-ITD-cDNA wurde das Dekamer CPSDNEYFYV als Zielpeptidantigen allogener T-Zellen gegen die ITD des Patienten IN identifiziert.rnrnUCB-Lymphozyten tragen überwiegend einen naiven Phänotyp. Sieben UCB-Spenden wurden ungeachtet ihres HLA-Typs auf CD8+ T-Zellantworten gegen die ITD der Patienten VE, IN, QQ, JC und FL untersucht. In fünf der sieben UCB-Spenden wurden ITD-spezifische Immunantworten gegen alle zur Stimulation eingesetzten ITD beobachtet. Die T-Zellfrequenzen gegen einzelne ITD in CD8+ Lymphozyten lagen bei 8x10-5 bis 3,6x10-6 und waren damit fast 15-fach höher als in BC-Lymphozyten. Restringierende HLA I-Moleküle wurden in 4/5 positiven UCB-Spenden ermittelt. Sie unterschieden sich mit einer Ausnahme von den Restriktionslelementen der patienteneigenen Immunantworten. In einer UCB-Spende wiesen T-Zellen gegen JC_FLT3-ITD die gleiche Peptidspezifität und HLA-Restriktion auf wie für autologe T-Zellen beschrieben (Graf et al., 2007). Weitere Analysen von ITD-reaktiven UCB-Lymphocyten führten zur Identifizierung des Dekamers YESDNEYFYV aus der FLT3-ITD der Patientin FL, das in Assoziation mit dem häufig vorkommenden HLA-A*02:01 erkannt wurde. Mit diesem Peptid ließen sich in vitro ITD-reaktive CD8+ T-Zellen aus UCB-Lymphozyten stimulieren und anreichern. Die peptidreaktiven T-Zellen erkannten nicht nur das ITD-Peptid, sondern auch mit FL_FLT3-ITD und HLA-A*02:01 ko-tranfizierte COS-7-Zellen. rnrnIn der vorliegenden Arbeit wurden T-Zellen gegen individuelle FLT3-ITD nicht nur aus Patientenblut, sondern auch aus allogenen Quellen generiert. Dabei wurden ITD-reaktive T-Zellen in Nabelschnurblut häufiger und in höheren Frequenzen nachgewiesen als in buffy coat-Lymphozyten. Es kam vor, dass allogene, ITD-reaktive T-Zellen die gleiche Peptidspezifität und HLA-Restriktion aufwiesen wie patienteneigene T-Zellen. Allogene, ITD-reaktive T-Zellen eignen sich, wie hier gezeigt, für die Identifizierung FLT3-ITD-kodierter Peptidantigene, beispielsweise zum künftigen Einsatz in therapeutischen Impfungstudien. Darüber hinaus können solche T-Zellen bzw. ihre Rezeptoren für den adoptiven Transfer verwendet werden.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2699
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-34164
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	103 S.
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