Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2696
Authors: Heller, Martin
Title: Design of cell adhesive and angiogenic titanium surfaces for cellular stimulation
Online publication date: 18-Apr-2013
Language: english
Abstract: Die Förderung der Zelladhäsion durch sogenannte biomimetische Oberflächen wird in der Medizin als vielversprechender Ansatz gesehen, um Komplikationen wie z. B. Fremdkörperreaktionen nach der Implantation entgegenzuwirken. Neben der Immobilisierung einzelner Biomoleküle wie z. B. dem RGD-Peptid, Proteinen und Wachstumsfaktoren auf verschiedenen Materialien, konzentriert man sich derzeit in der Forschung auf die Co-Immobilisierung zweier Moleküle gleichzeitig. Hierbei werden die funktionellen Gruppen z. B. von Kollagen unter Verwendung von nur einer Kopplungschemie verwendet, wodurch die Kopplungseffizienz der einzelnen Komponenten nur begrenzt kontrollierbar ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Immobilisierungsverfahrens, welches die unabhängige Kopplung zweier Faktoren kontrolliert ermöglicht. Dabei sollten exemplarisch das adhäsionsfördernde RGD-Peptid (Arginin-Glycin-Asparaginsäure) zusammen mit dem Wachstumsfaktor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf Titan gebunden werden. In weiteren Experimenten sollten dann die pro-adhäsiven Faktoren Fibronektin, Kollagen, Laminin und Osteopontin immobilisiert und untersucht werden. rnDie Aminofunktionalisierung von Titan durch plasma polymerisierte Allylaminschichten wurde als Grundlage für die Entwicklung des nasschemischen Co-immobilisierungsverfahren verwendet. Für eine unabhängige und getrennte Anbindung der verschiedenen Biomoleküle stand in diesem Zusammenhang die Entwicklung eines geeigneten Crosslinker Systems im Vordergrund. Die Oberflächencharakterisierung der entwickelten Oberflächen erfolgte mittels Infrarot Spektroskopie, Surface Plasmon Resonance Spektroskopie (SPR), Kontaktwinkelmessungen, Step Profiling und X-Ray Photoelectron Spektroskopie (XPS). Zur Analyse der Anbindungsprozesse in Echtzeit wurden SPR-Kinetik Messungen durchgeführt. Die biologische Funktionalität der modifizierten Oberflächen wurde in vitro an Endothelzellen (HUVECs) und Osteoblasten (HOBs) und in vivo in einem Tiermodell-System an der Tibia von Kaninchen untersucht.rnDie Ergebnisse zeigen, dass alle genannten Biomoleküle sowohl einzeln auf Titan kovalent gekoppelt als auch am Bespiel von RGD und VEGF in einem getrennten Zwei-Schritt-Verfahren co-immobilisiert werden können. Des Weiteren wurde die biologische Funktionalität der gebundenen Faktoren nachgewiesen. Im Falle der RGD modifizierten Oberflächen wurde nach 7 Tagen eine geförderte Zelladhäsion von HUVECs mit einer signifikant erhöhten Zellbesiedlungsdichte von 28,5 % (p<0,05) gezeigt, wohingegen auf reinem Titan Werte von nur 13 % beobachtet wurden. Sowohl VEGF als auch RGD/VEGF modifizierte Proben wiesen im Vergleich zu Titan schon nach 24 Stunden eine geförderte Zelladhäsion und eine signifikant erhöhte Zellbesiedlungsdichte auf. Bei einer Besiedlung von 7,4 % auf Titan, zeigten VEGF modifizierte Proben mit 32,3 % (p<0,001) eine deutlichere Wirkung auf HUVECs als RGD/VEGF modifizierte Proben mit 13,2 % (p<0,01). Die pro-adhäsiven Faktoren zeigten eine deutliche Stimulation der Zelladhäsion von HUVECs und HOBs im Vergleich zu reinem Titan. Die deutlich höchsten Besiedlungsdichten von HUVECs konnten auf Fibronektin mit 44,6 % (p<0,001) und Kollagen mit 39,9 % (p<0,001) nach 24 Stunden beobachtet werden. Laminin zeigte keine und Osteopontin nur eine sehr geringe Wirkung auf HUVECs. Bei Osteoblasten konnten signifikant erhöhte Besiedlungsdichten im Falle aller pro-adhäsiven Faktoren beobachtet werden, jedoch wurden die höchsten Werte nach 7 Tagen auf Kollagen mit 90,6 % (p<0,001) und Laminin mit 86,5 % (p<0,001) im Vergleich zu Titan mit 32,3 % beobachtet. Die Auswertung der Tierexperimente ergab, dass die VEGF modifizierten Osteosyntheseplatten, im Vergleich zu den reinen Titankontrollen, eine gesteigerte Knochenneubildung auslösten. Eine solche Wirkung konnte für RGD/VEGF modifizierte Implantate nicht beobachtet werden. rnInsgesamt konnte gezeigt werden, dass mittels plasmapolymerisierten Allylamin Schichten die genannten Biomoleküle sowohl einzeln gebunden als auch getrennt und kontrolliert co-immobilisiert werden können. Des Weiteren konnte eine biologische Funktionalität für alle Faktoren nach erfolgter Kopplung in vitro gezeigt werden. Wider Erwarten konnte jedoch kein zusätzlicher biologischer Effekt durch die Co-immobilisierung von RGD und VEGF im Vergleich zu den einzeln immobilisierten Faktoren gezeigt werden. Um zu einer klinischen Anwendung zu gelangen, ist es nun notwendig, das entwickelte Verfahren in Bezug auf die immobilisierten Mengen der verschiedenen Faktoren hin zu optimieren. rn
In medicine the enhancement of cell adhesion is regarded as promising approach of research to counteract complications after implantation such as foreign body reactions. Parallel to the single immobilization of biomolecules such as the RGD-peptide, proteins or growth factors onto various materials, current research is focused on the co-immobilization of two different molecules. For example, functional groups of collagen are used for the co-immobilization which, however, utilizes only one type of coupling chemistry. In this case, the coupling efficiency of the single components provides only limited control. The aim of this work was the design of an immobilization procedure for the independent and controllable conjugation of two factors. For this purpose, the adhesion enhancing RGD-peptide (arginine-glycine-aspartate) and the vascular endothelial growth factor (VEGF) were to be conjugated exemplarily onto titanium. Furthermore, pro-adhesive factors such as fibronectin, collagen, laminin and osteopontin were to be investigated after immobilization.rnThe amino-functionalization of titanium via plasma polymerized allylamine was used as base for the wet chemical co-immobilization procedure. In this context, the development of a suitable cross-linker system for an independent and separated biomolecule conjugation was prioritized. For the surface characterization infrared spectroscopy, surface plasmon resonance spectroscopy (SPR), contact angle measurements, step profiling and x-ray photoelectron spectroscopy (XPS) were utilized. Real-time analysis of the conjugation processes were performed via SPR kinetic measurements. The biological functionality of the modified surfaces was investigated in vitro with endothelial cells (HUVECs) and osteoblasts (HOBs) and in vivo in an animal model system at the tibia of rabbits.rnThe results reveal that all mentioned biomolecules could be conjugated independently onto titanium and co-immobilized in a separated two-step procedure, as shown by the example of RGD and VEGF. Furthermore, the biological functionality of the conjugated factors could be proven. In the case of RGD modified surfaces, an enhanced cell adhesion and a significantly increased cell coverage (p<0,05) of HUVECs was observed after 7 days with 28,5 % compared to titanium with 13 %. VEGF as well as RGD/VEGF modified samples exhibited a promoted cell adhesion and significantly increased values for the cell coverage already after 24 hours. In comparison to pure titanium with a cell coverage of 7,4 %, a more distinct effect on HUVECs was observed for VEGF modified surfaces with 32,3 % (p<0,001) compared to RGD/VEGF modified samples with 13,2 % (p<0,01). The pro-adhesive factors led to a distinct stimulation of cell adhesion of HUVECs and HOBs in comparison to pure titanium. By far the highest cell coverage of HUVECs was observed on fibronectin modified surfaces with 44,6 % (p<0,001) and on collagen with 39,9 % (p<0,001) after 24 hours. For laminin no effect was observed, and for osteopontin only a slight enhancement of cell adhesion on HUVECs was found. In the case of osteoblasts, significantly increased cell coverage on all samples with pro-adhesive factors was observed, but the highest values were observed on collagen with 90,6 % (p< 0,001) and laminin with 86,5 % (p<0,001) compared to titanium with 32,3 % after 7 days. The analysis of the animal experiments revealed that VEGF modified osteosynthesis plates triggered new bone formation, compared to the non-modified titanium controls. Such effects were not observed in the case of RGD/VEGF modified implants.rnAltogether, it was found that plasma polymerized allylamine is suitable for the conjugation of the mentioned biomolecules as well as for a separated and controlled co-immobilization. Furthermore, the biological functionality of all used factors could be demonstrated in vitro after immobilization. Against expectation, no additional biological effect as result of the RGD and VEGF co-immobilization could be demonstrated. In order to transfer the developed surfaces to clinical applications, it will be necessary to optimize the developed procedures concerning the amounts of the immobilized factors.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
MaxPlanck GraduateCenter
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2696
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 137 S.
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