Molekulare Mechanismen der Osmoregulation in Magnaporthe oryzae und deren Modulation durch das Fungizid Fludioxonil
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Abstract
Zusammenfassung
Die stetig größer werdende Herausforderung und unausweichliche, globale Problematik zunehmender Fungizidresistenzen phytopathogener Pilze ist hochaktuell. Das Fungizid Fludioxonil, welches den für die pilzliche Osmoregulation verantwortlichen „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg moduliert, wird seit mehr als 20 Jahren weltweit in der Landwirtschaft eingesetzt – bisher ohne nennenswerte Resistenzbildungen. Der molekulare Wirkmechanismus dieses Fungizids ist noch weitgehend unverstanden und dessen Erforschung deshalb von höchster Relevanz für den integrierten Pflanzenschutz. Die im Rahmen dieser Arbeit mit dem filamentösen Ascomycet Magnaporthe oryzae (M. oryzae) erzielten Ergebnisse zu molekularen Mechanismen der Wirkungsweise von Fludioxonil und zu sensorischen Funktionen von Zweikomponenten-Hybrid-Histidinkinasen (HKs) werden dazu einen wertvollen Beitrag liefern.
Es konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass es neben Genen, welche bisher bekannte Proteine des HOG-Signalwegs von M. oryzae kodieren, noch weitere Komponenten gibt, deren genetische Manipulation zu einer veränderten Fludioxonil-Suszeptibilität in filamentösen, phytopathogenen Pilzen führt. Die homologe Überexpression der Phosphatase MoPtp2p resultierte in einer Fludioxonil-resistenten Mutante mit reduziertem Phosphorylierungsgrad der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) MoHog1p. Inaktivierung von MoPTP2 resultierte hingegen in einem Fludioxonil-sensitiven Phänotyp. Daraus kann geschlossen werden, dass MoPtp2p am Prozess der Signaltransduktion im HOG-Signalweg und auch entscheidend an der Wirkungsweise des Fungizids Fludioxonil beteiligt ist.
Die für die Osmoregulation essentielle MAPK MoHog1p transloziert nach Aktivierung vom Zytosol in den Zellkern. Durch Proteinfusion von MoHog1p mit dem Fluoreszenzprotein GFP konnte ein molekulares Werkzeug generiert werden, welches umfassende Analysen zur Aktivierung des HOG-Signalwegs erlaubt. Durch Expression des Fusionsproteins MoHog1p GFP in verschiedenen "loss of function"-Mutanten, bei denen einzelne Komponenten des HOG-Signalwegs inaktiviert sind, konnten so Untersuchungen zur Signalspezifität in diesem Signalweg durchgeführt werden. Unterstützt wurden Ergebnisse durch Untersuchungen des Primärmetabolismus von M. oryzae zur intrazellulären Akkumulation von Osmolyten nach Induktion mit diversen Stimuli.
Zum einen konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass Fludioxonil-Applikation analog zu hyperosmotischen Stimuli in M. oryzae zur Translokation von MoHog1p in den Zellkern führt, sowie die intrazelluläre Akkumulation des Osmolyts Arabitol bewirkt. Die molekularen Mechanismen der Perzeption und der Signaltransduktion bei Fludioxonil-Stress und hyperosmotischem Stress unterscheiden sich jedoch. Für eine Translokation von MoHog1p in den Zellkern und eine intrazelluläre Akkumulation von Arabitol bei Fludioxonil-Stress ist die Anwesenheit der Gruppe III HK MoHik1p essentiell. Für eine nukleäre Translokation von MoHog1p und eine adäquate intrazelluläre Akkumulation von Arabitol bei hyperosmotischem Schock hingegen nicht.
Zum anderen konnte die Hypothese einer spezifischen Detektion von Salzstress bzw. Zuckerstress durch die HKs MoSln1p bzw. MoHik1p untersucht und schließlich spezifiziert werden: MoSln1p bzw. MoHik1p detektieren vermutlich nicht direkt Salz- oder Zuckerkonzentrationen, sondern wahrscheinlich sekundär unterschiedliche zelluläre Mechanismen oder Zustände, welche mit langfristigem Salz- oder Zuckerstress assoziiert sind oder dadurch jeweils spezifisch ausgelöst werden – nämlich möglicherweise Ionenstress, Hypoxie, oxidativen Stress, und/oder Änderungen im zellulären Redoxpotential.
Weiterhin konnten potentiell unterschiedliche Aktivierungsmechanismen des HOG-Signalwegs postuliert werden, welche abhängig vom Stimulus entweder in einer direkten (hyperosmotischer Schock, Fludioxonil-Stress) oder verspäteten (Hypoxie / oxidativer Stress / Redox-Stress) Translokation von MoHog1p in den Zellkern resultieren.