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Authors: Bohnert, Stefan
Title: Molekulare Mechanismen der Osmoregulation in Magnaporthe oryzae und deren Modulation durch das Fungizid Fludioxonil
Online publication date: 10-Feb-2020
Year of first publication: 2020
Language: german
Abstract: Zusammenfassung Die stetig größer werdende Herausforderung und unausweichliche, globale Problematik zunehmender Fungizidresistenzen phytopathogener Pilze ist hochaktuell. Das Fungizid Fludioxonil, welches den für die pilzliche Osmoregulation verantwortlichen „High Osmolarity Glycerol“ (HOG)-Signalweg moduliert, wird seit mehr als 20 Jahren weltweit in der Landwirtschaft eingesetzt – bisher ohne nennenswerte Resistenzbildungen. Der molekulare Wirkmechanismus dieses Fungizids ist noch weitgehend unverstanden und dessen Erforschung deshalb von höchster Relevanz für den integrierten Pflanzenschutz. Die im Rahmen dieser Arbeit mit dem filamentösen Ascomycet Magnaporthe oryzae (M. oryzae) erzielten Ergebnisse zu molekularen Mechanismen der Wirkungsweise von Fludioxonil und zu sensorischen Funktionen von Zweikomponenten-Hybrid-Histidinkinasen (HKs) werden dazu einen wertvollen Beitrag liefern. Es konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass es neben Genen, welche bisher bekannte Proteine des HOG-Signalwegs von M. oryzae kodieren, noch weitere Komponenten gibt, deren genetische Manipulation zu einer veränderten Fludioxonil-Suszeptibilität in filamentösen, phytopathogenen Pilzen führt. Die homologe Überexpression der Phosphatase MoPtp2p resultierte in einer Fludioxonil-resistenten Mutante mit reduziertem Phosphorylierungsgrad der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) MoHog1p. Inaktivierung von MoPTP2 resultierte hingegen in einem Fludioxonil-sensitiven Phänotyp. Daraus kann geschlossen werden, dass MoPtp2p am Prozess der Signaltransduktion im HOG-Signalweg und auch entscheidend an der Wirkungsweise des Fungizids Fludioxonil beteiligt ist. Die für die Osmoregulation essentielle MAPK MoHog1p transloziert nach Aktivierung vom Zytosol in den Zellkern. Durch Proteinfusion von MoHog1p mit dem Fluoreszenzprotein GFP konnte ein molekulares Werkzeug generiert werden, welches umfassende Analysen zur Aktivierung des HOG-Signalwegs erlaubt. Durch Expression des Fusionsproteins MoHog1p GFP in verschiedenen "loss of function"-Mutanten, bei denen einzelne Komponenten des HOG-Signalwegs inaktiviert sind, konnten so Untersuchungen zur Signalspezifität in diesem Signalweg durchgeführt werden. Unterstützt wurden Ergebnisse durch Untersuchungen des Primärmetabolismus von M. oryzae zur intrazellulären Akkumulation von Osmolyten nach Induktion mit diversen Stimuli. Zum einen konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass Fludioxonil-Applikation analog zu hyperosmotischen Stimuli in M. oryzae zur Translokation von MoHog1p in den Zellkern führt, sowie die intrazelluläre Akkumulation des Osmolyts Arabitol bewirkt. Die molekularen Mechanismen der Perzeption und der Signaltransduktion bei Fludioxonil-Stress und hyperosmotischem Stress unterscheiden sich jedoch. Für eine Translokation von MoHog1p in den Zellkern und eine intrazelluläre Akkumulation von Arabitol bei Fludioxonil-Stress ist die Anwesenheit der Gruppe III HK MoHik1p essentiell. Für eine nukleäre Translokation von MoHog1p und eine adäquate intrazelluläre Akkumulation von Arabitol bei hyperosmotischem Schock hingegen nicht. Zum anderen konnte die Hypothese einer spezifischen Detektion von Salzstress bzw. Zuckerstress durch die HKs MoSln1p bzw. MoHik1p untersucht und schließlich spezifiziert werden: MoSln1p bzw. MoHik1p detektieren vermutlich nicht direkt Salz- oder Zuckerkonzentrationen, sondern wahrscheinlich sekundär unterschiedliche zelluläre Mechanismen oder Zustände, welche mit langfristigem Salz- oder Zuckerstress assoziiert sind oder dadurch jeweils spezifisch ausgelöst werden – nämlich möglicherweise Ionenstress, Hypoxie, oxidativen Stress, und/oder Änderungen im zellulären Redoxpotential. Weiterhin konnten potentiell unterschiedliche Aktivierungsmechanismen des HOG-Signalwegs postuliert werden, welche abhängig vom Stimulus entweder in einer direkten (hyperosmotischer Schock, Fludioxonil-Stress) oder verspäteten (Hypoxie / oxidativer Stress / Redox-Stress) Translokation von MoHog1p in den Zellkern resultieren.
Summary The results of this work concerning the molecular mechanisms of the mode of action of the fungicide fludioxonil and on signaling functions of two-component hybrid histidine kinases (HKs) will make valuable contributions to the integrated plant protection management. It could be demonstrated that apart from genes known so far coding for proteins of the "High Osmolarity Glycerol" (HOG) signaling pathway, there are more components involved in fludioxonil susceptibility in the filamentous phytopathogenic fungus Magnaporthe oryzae. Homologous overexpression of the phosphatase MoPtp2p resulted in a fludioxonil resistant mutant with low MoHog1p phosphorylation, thus exhibiting a new molecular mechanism of fungicide resistance. Likewise, inactivation of MoPTP2 led to a fludioxonil hypersensitive phenotype. In conclusion MoPtp2p is involved in the signal transduction process in the HOG signaling pathway and is also crucial for the mode of action of the fungicide fludioxonil. The mitogen activated protein kinase MoHog1p, which is essential for osmoregulation, translocates from the cytosol into the nucleus upon pathway activation. Fusion of MoHog1p with the fluorescence protein GFP generated a molecular tool suitable for comprehensive visualization of HOG pathway activation. Expression of the fusion protein MoHog1p-GFP in various loss of function mutants of the HOG signaling pathway enabled sophisticated investigations of signaling specificity. These findings were supported by analyses of metabolomic changes upon application of varied stressors. Thus, it could be demonstrated that fludioxonil treatment leads to nuclear translocation of MoHog1, as well as to intracellular accumulation of the osmolyte arabitol – analogous to hyperosmotic shocks. However, the underlying molecular mechanisms for perception of fludioxonil stress and hyperosmotic stress differ. MoHik1p is essential for nuclear translocation of MoHog1p and intracellular accumulation of arabitol during fludioxonil stress, but not during hyperosmotic stress. Furthermore, the hypothesis of a specific detection of high molar salt or sugar stress by the HKs MoSln1p or MoHik1p could be investigated and finally specified: MoSln1p or MoHik1p do not detect specificly salt- or sugar concentrations, however, they probably detect secondary mechanisms or states associated with or initiated by long-term salt stress or long-term sugar stress – i.e. ion stress, hypoxia, oxidative stress and/or changing cellular redox potential. Finally two distinct HOG pathway activation mechanisms could be postulated, which result dependend on the stimulus in a rapid (hyperosmotic shock, fludioxonil stress) or delayed (hypoxia / oxidative stress / redox stress) nuclear translocation of MoHog1p.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2681
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000033565
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XI, 128 Seiten
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