Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2675
Authors: Schmelter, Carsten
Title: De novo screening of new biomarker candidates in primary open-angle glaucoma (POAG)
Online publication date: 5-Feb-2020
Language: english
Abstract: Glaucoma is a neurodegenerative eye disease manifested by the slow progressive loss of retinal ganglion cells (RGC) and their axons, leading to optic nerve damages and visual field defects. Although glaucoma is clinically well known for many years by now, the elevated intraocular pressure (IOP) remains the major risk factor for the development of glaucoma and IOP-lowering medications still represent the gold standard in glaucoma therapy. However, rather than preventing or even curing the neurological damages the current therapeutic approaches can just delay and slow down the disease progression. These circumstances emphasize the urgent need for the development of new diagnostic or therapeutic strategies in order to provide a personalized medical management for each glaucoma patient. The main objective of this doctoral thesis was to characterize the highly diverse antibody repertoire by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based quantitative proteomics and to identify new specific and sensitive biomarker candidates. As most important result, we identified 75 peptides of the variable IgG domain as potential biomarkers in primary-open angle glaucoma (POAG) patients. Moreover, we observed significant shifts in the variable heavy chain family distribution and disturbed κ/λ ratios in POAG patients strengthening the assumption of glaucoma-induced effects on the systemic humoral immune response. As second part of the project, we proved the neuroprotective potential of synthetic glaucoma associated complementarity-determining regions (CDR) on RGCs ex vivo. Particularly, the treatment with CDR1 peptide ASGYTFTNYGLSWVR resulted in about 30 % significant higher RGC survival rates which can possibly be traced back to the active inhibition or modulation of the molecular function of mitochondrial protein serine protease HTRA2. This specific peptide-protein interaction led to significant lesser cellular stress responses and increased activation of antioxidative signaling pathways in the CDR-treated retinal explants. As final part of this doctoral thesis, we compared the analytical performance of two solid phase extraction (SPE) methods for sample clean-up and peptide enrichment prior to LC MS analysis. The retinal proteome of the house swine (Sus scrofa domesticus) provides excellent requirements for this qualitative as well as quantitative MS-based comparison and delivered convincing results in terms of ocular proteomics. Both SPE systems worked equally well regarding sensitivity, reproducibility and protein/peptide recovery. But in terms of analysis speed and semi-automation, the centrifugal-based SPE technology (SOLAµTM HRP) clearly benefits compared to the pipette tip-based SPE method (ZIPTIP® C18). In conclusion, the present doctoral thesis provided deep and detailed insights into the complex autoimmune processes in the pathophysiology of glaucoma and emphasized synthetic CDR peptides as innovative new strategy in future glaucoma therapy. Moreover, the faster and more standardized analytical procedure for the LC-MS analysis will facilitate the management as well as coordination of high-throughput study designs and will significantly increase the quality of large-scale research projects in future.
Das Glaukom beschreibt eine neurodegenerative Erkrankung des Auges, charakterisiert durch den langsamen, progressiven Verlust der retinalen Ganglionzellen (RGZ) und deren Axone, gefolgt von Schäden am Sehnerv und irreversiblen Gesichtsfeldausfällen. Seit vielen Jahren ist ein erhöhter Augeninnendruck (IOD) als wichtiger Hauptrisikofaktor für die Entwicklung eines Glaukoms bekannt und IOD-senkende Medikamente bilden nach wie vor den Goldstandard in der Glaukom-Therapie. Nichtsdestotrotz führen die derzeitig verfügbaren Therapieansätze nur zu einer Verlangsamung des eigentlichen Krankheitsverlaufs, aber können ein Fortschreiten der neurologischen Schäden weder verhindern noch heilen. Aus diesen Gründen ist es von entscheidender Bedeutung neue diagnostische oder therapeutische Strategien zu entwickeln, um eine personalisierte und angemessene medizinische Behandlung der Glaukom-Patienten zu gewährleisten. Das Hauptziel dieser Forschungsarbeit war es, dass hochdiverse Antikörperrepertoire mittels der Hochflüssigkeitschromatographie-massenspektrometrisch (LC-MS)-basierten Proteomik zu analysieren und neue spezifische sowie sensitive Immun-Peptidmarker zu detektieren. Als primäres Resultat konnten wir 75 Peptide der variablen IgG Domäne als potenzielle Biomarker des primären Offenwinkelglaukoms (POWG) identifizieren. Des Weiteren konnten wir signifikante Unterschiede innerhalb des variablen Gensegment-Expressionsprofils der schweren Kette sowie gestörte κ/λ-Verhältnisse in POWG-Patienten feststellen, die auf Glaukom-induzierte Effekte innerhalb der systemisch humoralen Immunantwort hindeuten. Im weiteren Rahmen dieser Arbeit wurde das neuroprotektive Potenzial von synthetischen Glaukom-assoziierten hypervariablen Regionen (HVR) auf RGZ ex vivo überprüft. Vor allem das HVR1-Sequenzmotiv ASGYTFTNYGLSWVR konnte eine um 30 % signifikant erhöhte RGZ Überlebensrate induzieren, welche wahrscheinlich auf die aktive Inhibierung oder Modulierung der Proteinaktivität der mitochondrialen Serinprotease HTRA2 zurückzuführen ist. Außerdem führte diese spezifische Peptid-Protein Interaktion zu einer signifikant verminderten zellulären Stressantwort und zu einer vermehrten Aktivierung von antioxidativen Signalwegen in den HVR-behandelten retinalen Explantaten. Zum Abschluss dieser Forschungsarbeit wurden zwei Festphasenextraktionsmethoden (FPE), welche hauptsächlich zur Probenaufreinigung bzw. Peptidanreicherung vor der LC-MS Analyse dienen, hinsichtlich ihrer analytischen Leistungsfähigkeit miteinander verglichen. Das retinale Proteom des Hausschweins (Sus scrofa domesticus) bietet exzellente Voraussetzungen für diesen MS-basierten qualitativen als auch quantitativen Vergleich und sollte daher auch eine aussagekräftige Beurteilung beider Systeme hinsichtlich der Anwendung auf Augen spezifische Proteinmarker erlauben. Beide FPE-Systeme zeigten vergleichbare Resultate bezüglich der Sensitivität, Reproduzierbarkeit und der spezifischen Protein/Peptid Detektionsrate während der LC-MS Analyse. Allerdings in Anbetracht der Analysegeschwindigkeit und des halbautomatisierten Anwendungsprotokolls bietet die Zentrifugen-kompatible FPE-Technologie (SOLAµTM HRP) deutlich mehr Vorteile als das Pipettenspitzen-basierte FPE-System (ZIPTIP® C18). Die Ergebnisse dieser Forschungsarbeit konnten einen tiefen und detaillierten Einblick in die komplexen, autoimmun-assoziierten Prozesse der Glaukom-Erkrankung geben und belegen darüber hinaus das große, neuroprotektive Potenzial von synthetischen HRP-Peptiden in der zukünftigen Glaukom-Therapie. Darüber hinaus wird das schnellere als auch standardisierte FPE-basierte Probenvorbereitungsprotokoll für die LC-MS Analyse die Planung und Koordination von Hochdurchsatz-orientierten Studiendesigns deutlich erleichtern und die Qualität von zukünftigen Großforschungsprojekten erheblich steigern.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2675
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000033170
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XII, 17, 43 Blätter, 30 Blätter in verschiedenen Zählungen
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