Authors:	Bohne, Florian
Title:	Transkriptionelle Regulation geprägter Gene durch inter‐ und intra‐chromosomale Interaktionen
Online publication date:	15-May-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	Auf Chromosom 11p15.5 befinden sich zwei Cluster geprägter Gene. Die Gene jedes Clusters werden abhängig von ihrer parental differenziell methylierten ICR allelspezifisch exprimiert. (Epi)genetische Veränderungen dieser Region sind häufig mit den seltenen Imprintingerkrankungen SRS und BWS assoziiert, aber auch Veränderungen wie beispielsweise auf Chromosom 7 können zu SRS führen. Die betroffenen Gene sind alle Teil eines gemeinsam regulierten IGN. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Expression verschiedener Gene von Chromosom 7 und 11 sowie des IGN in Fibroblasten von je zwei verschiedenen SRS‐(matUPD7 und matUPD11) und BWS‐Patienten (patUPD11 und maternale Deletion der ICR1/H19) untersucht, um mögliche transkriptionelle Unterschiede oder Gemeinsamkeiten festzustellen. Für IGF2 ergab sich eine erhöhte Expression in den BWSZellen im Vergleich zu den SRS‐Zellen, während es für H19, abgesehen von der nicht vorhandenen Expression in den Zellen, welche die maternale Deletion aufweisen, keine signifikanten Unterschied gab. Im IC2 wies das Gen KCNQ1OT1 mit einer niedrigen Expression in beiden SRS‐Zellkulturen und einer erhöhten Expression in den beiden BWS‐Zellkulturen reziproke Gemeinsamkeiten auf. Während die Expression des Gens CDKN1C, welches laut Literatur direkt von KCNQ1OT1 beeinflusst sein sollte, nur in SRSUPD11 und BWSUPD11 mit der KCNQ1OT1‐Expression korrelierte. Im Zusammenhang mit dem IGN wies neben IGF2 und KCNQ1OT1 auch das Gen MEST mit geringen Transkriptmengen bei SRS und erhöhten bei BWS ein reziprokes Expressionsmuster für die beiden Krankheitsentitäten auf. Ein möglicher regulativer Faktor, welcher in der ICR1 bindet ist Kaiso. Verschiedene Analysen zeigten, dass das Kaiso für den Methylierungserhalt der ICR1 und auch für die transkriptionelle Regulierung von IGF2 und H19 verantwortlich ist. Ob die ICR1 auf MEST und weitere IGN‐Gene über eine physische Interaktion regulativ wirken kann, konnte mittels der durchgeführten 4C‐Analyse nicht gefunden werden. Eine Interaktionsanalyse mittels T2C lieferte Hinweise für cis‐ Interaktionen der CS7‐Enhancerregion mit ICR1‐nahen Bereichen. Etwa 500 Basen entfernt von CS7 konnten mehrere putative P53‐Bindestellen lokalisiert werden. Daher wurde die funktionelle Relevanz von P53 mittels Nutlin‐3a‐Behandlung bzw. Bestrahlung und einem P53‐ Knockdown untersucht. Für den Nachweis der P53‐Bindung wurde im Anschluss an die Stabilisierung mittels Nutlin‐3a eine ChIP bzw. ChIP‐Seq durchgeführt. Die ChIP (‐Seq)‐Daten lieferten jedoch keine Hinweise auf eine P53‐Bindung für die Region bei CS7, die ICR1, den H19‐Promoter oder die IGF2‐Promotoren. Die Expressionsanalysen der verschiedenen P53‐ Stabilisierungen ergaben unterschiedliche Ergebnisse. Während nach der Nutlin‐3a‐ Behandlung IGF2 und H19 im Mittel unverändert waren, ergab sich nach der Bestrahlung eine Reduktion von H19 in beiden untersuchten SRS‐Zellkulturen. Im Vergleich dazu wurde nach dem P53‐Knockdown eine Erhöhung von IGF2 in den SRS UPD11‐Zellen festgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass unterschiedliche Behandlungen der Zellen differenzielle P53‐Effekte hervorrufen können. Darüber hinaus ist eine Bindung an den CS7‐Bereich und damit einhergehend weitere Funktionen in anderen Zellen oder Geweben möglich. The allele specific expression of the genes of the two imprinting clusters on chromosome 11p15.5 are dependent on the parentally differentially methylation of their ICRs. (Epi)genetic defects on chromosome 11p15.5 are often associated with the rare imprinting disorders SRS and BWS. However, approximately 10 % of the SRS patients can also show epigenetic changes on chromosome 7 including a maternal uniparental disomy. The affected genes are all part of a common regulated IGN. To analyze expressional differences or similarities of SRS and BWS different genes on chromosome 7 and 11 and the IGN were checked for their expression in two different SRS‐(matUPD7 and matUPD11) and two different BWS‐(patUPD11 and maternale deletion of ICR1/H19) patients. IGF2 showed an increased expression in BWS‐cells compared to SRS‐cells, whereas no significant changes for H19 could be observed, with exception for the cells harboring the maternal deletion, which showed no H19‐transcript. For IC2 SRS‐cells showed a low expression of KCNQ1OT1 and BWS‐cells a high expression respectively. Although direct effects of KCNQ1OT1 on CDKN1C are supposed in literature these findings only corelate in SRS UPD11 and BWS UPD11 with the KCNQ1OT1‐expression. In context of the IGN the gene MEST, as well as the genes IGF2 KCNQ1OT1, showed low transcript levels in the SRS‐cells and high levels in BWS. One regulatory factor which can bind in the ICR1 is the protein Kaiso. Different analyzes revealed that Kaiso is involved in the methylation maintenance of the ICR1 and transcriptional regulation of H19 and IGF2. 4C analysis did not reveal a regulatory physical interaction between the ICR1 and MEST or to other imprinted regions. Further interaction analysis (T2C) suggested cis‐interactions of the CS7‐enhancer region to areas near the ICR1. Several putative P53‐binding sites could be located close to CS7. The functional relevance was analyzed by P53‐stabilization via N3a treatment, irradiation or P53‐knockdown. Following the N3a stabilization of P53 the binding of P53 to the DNA was checked by ChIP and ChIP‐Seq. The ChIP(‐Seq) gave no hints for a P53 binding to the region of CS7, the ICR1, the H19‐promoter or the IGF2‐promoters. The expression analysis of the various P53‐stabilizations revealed different results. While there were no changes of IGF2 and H19 after N3a‐treatment, there was a significant reduction of H19 in both SRS‐cell cultures following irradiation. In contrast to these findings there was an increase of IGF2 in the SRS UPP11‐cells after P53‐knockdown. These results showed that various treatments lead to different P53‐effects. However, binding to the area near CS7 is possible and may offer functions in other cells or tissues.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2672
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000019977
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	IX, 185 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen