Authors:	Robeska, Elena
Title:	Role of SIRT1 and SIRT6 for the preservation of genetic stability
Online publication date:	13-May-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	Genome stability is very important for all living organisms and is constantly under threat because of the exposure to different environmental and endogenous DNA damaging agents. Genome instability, for example in consequence of defective DNA repair, is an important risk factor for the initiation of carcinogenesis. Aim of this study was to investigate the influence of SIRT1 and SIRT6 on genome stability. Sirtuins are NAD+-dependent deacetylases of histones and other proteins that could influence base excision repair (BER) by modulating chromatin accessibility, by modifying enzymes involved in DNA repair or by affecting metabolism and the production of reactive oxygen species (ROS) that will increase DNA damage load. For investigation of these hypotheses, SIRT1 overexpressing and deficient cells were used, as well as Sirt6-/- knock-out and Sirt6-/-/Ogg1-/- double knock-out. The micronucleus assay was used as indicator for genome instability. DNA damage and repair were measured by an alkaline elution assay. A DNA relaxation assay was used for the analyses of APE1 activity. In this study, a mechanism for micronuclei generation from SSBs as a result of impaired base excision repair pathway due to SIRT1-modulated APE1 activity was proposed. More SSBs in SIRT1 deficient cells lead to higher number of micronuclei, as result of increased APE1 cleavage activity and genomic instability. Reduced APE1-endonuclease activity in SIRT1 overexpressing cells results in less SSBs generation and lower number of micronuclei, suggesting a protective role of SIRT1 on genome stability. Interestingly, the activity of SIRT1 was found to be stimulated by oxidative stress. Thus the APE1 activity in cell extracts was reduced after treatment with bromate in normal, but not in SIRT1 deficient cells, while SIRT1-overexpressing cells exhibit low APE1 activity, independent of oxidative stress. An unexpected accumulation of AP sites and SSBs in MMS-treated SIRT1-deficient cells suggests an additional influence of SIRT1 on the activity of methyl purine glycosylase (MPG), another repair enzyme. In summary, the results demonstrate that SIRT1 plays a previously unknown role in the preservation of the genetic stability of cells. By its influence on the processing of AP sites (via a regulation of APE1 activity) it prevents an unbalanced base excision repair, in particular an accumulation of SSBs as repair intermediates, which would cause chromosome breaks and micronuclei formation. Many questions regarding the relevance of SIRT6 for genetic stability remain unanswered due to the low number and early death of SIRT6 deficient animals that could be generated. However, results in this study clearly demonstrate that SIRT6 has no influence on the resealing of SSBs. An unexpected protective role of SIRT6 deficiency on genome stability, which was only observed in combination with OGG1 deficiency, raises new questions about a mechanistic interaction / interplay of these two proteins. Further investigations (and more animals) are needed for any conclusions about the role of SIRT6 on genome stability and the proteins involved. Genomische Stabilität ist von großer Bedeutung für alle Organismen und ist andauernd exogenen sowie endogenen DNA schädigenden Noxen ausgesetzt. Genomische Instabilität, zum Beispiel eine fehlerhafte DNA Reparatur, ist ein wichtiger Risikofaktor für die Initiation der Krebsentstehung. Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, welchen Einfluss Sirt1 und Sirt6 auf die genomische Stabilität besitzen. Sirtuine sind NAD+ abhängige Deacetylasen von Histonen und anderen Proteinen, welche die Basenexcisionsreparatur (BER) beeinflussen können. Die kann geschehen, durch Modulation der Chromatinzugänglichkeit, durch Modifizierung von DNA-Reparaturenzymen oder durch Beeinflussung des Metabolismus und die Produktion von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), was abschließend zu erhöhten DNA Schäden führt. Zur Untersuchung dieser Hypothesen wurden Sirt1 überexprimierende und -defiziente Zellen, sowie Sirt6 knock out und Sirt6/Ogg1 doppel knock-out Mäuse verwendet. Als Indikator für Genomischen Instabilität wurde der Mikrokern-Assay verwendet. DNA Schäden und DNA-Reparatur wurden mittels der Methode der Alkalischen Elution gemessen und die APE1 Aktivität wurde über einen DNA Relaxations Assay ermittelt. In dieser Arbeit wurde ein Mechanismus für die Generierung von Mikrokernen nach Einzelstrangbrüchen (SSB) als Resultat der beeinträchtigten Basenexcisionreparatur durch SIRT1 modulierter APE1 Aktivität postuliert. Erhöhte APE1 Cleavage Aktivität und genomische Instabilität führen zu erhöhten Spiegeln von SSB und somit zu einer erhöhten Mikrokernrate in SIRT1 defizienten Zellen. Eine verminderte APE1-Endonuklease Aktivität in Sirt1 überexprimierenden Zellen führt zu weniger SSBs und somit zu einer niedrigeren Mikrokernrate. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass Sirt1 eine schützende Rolle auf die genomische Stabilität hat. Interessanterweise wird die Aktivität von Sirt1 durch oxidativen Stress stimuliert. Die Behandlung mit Kaliumbromat führte zu einer geringeren APE1 Aktivität in Zellextrakten von Wildtypzellen, jedoch nicht in SIRT1 defizienten Zellen. Sirt1 überexprimierende Zellen jedoch, zeigen eine geringe APE1 Aktivität, unabhängig vom Spiegel an oxidativem Stress. Nicht erwartet war die Akkumulation von AP Stellen und SSBs nach der Behandlung von SIRT1 defizienten Zellen mit MMS. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme dass Sirt1 eine zusätzliche Rolle spielt bei der Aktivität des Reparaturenzyms MPG (Methylpuringlykosylase). Die Ergebnisse dieser Arbeit demonstrieren eine bis dahin noch unbekannte Rolle von Sirt1 beim Schutz der genomischen Stabilität von Zellen. Sirt1 beeinflusst das Prozessieren von AP sites (über die Regulation der APE1 Aktivität). Es verhindert ein Ungleichgewicht der BER, genauer eine Akkumulation des SSB Reparaturintermediates, welches zu Chromosomenbrüchen und Mikrokernen führen würde. Da nur wenige SIRT6 knock out Mäuse generiert werden konnten, aufgrund der niedrigen Tierzahl und des frühen Sterbens der Tiere, bleiben viele Fragen bzgl. der Rolle von Sirt6 im Zusammenhang mit genomischer Stabilität unbeantwortet. Jedoch konnte gezeigt werden, dass Sirt6 keinen Einfluss auf das Resealingvon SSBs hat. Eine Sirt6 Defizienz, nur in Kombination mit einer Ogg1 Defizienz, zeigte unerwartet eine protektive Rolle genomischer Stabilität. Dies wirft neue Fragen über den Mechanismus und das Zusammenspiel dieser beiden Proteine auf. Weitere Untersuchungen (und eine höhere Tierzahl) werden benötigt, um weiteren Aufschluss der Rolle von Sirt6 und anderer involvierter Proteine auf die genomische Stabilität zu erhalten.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2668
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000019905
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	V, 109 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen