Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-2635
Authors: Ponath, Viviane
Title: The effect of reactive oxygen species on monocytes and macrophages
Online publication date: 9-Mar-2018
Language: english
Abstract: The myeloid immune system is the first line of defence against infections. The acute inflammatory response encompasses the recruitment of immune cells to the site of inflammation, the production of cytokines, phagocytosis of foreign material and the release of reactive oxygen species (ROS) to kill pathogens. The latter is accomplished by the NADPH oxidase which generates superoxide anions from molecular oxygen and releases them against pathogens. Previously, it was shown that monocytes, but not macrophages and dendritic cells (DCs), lack the DNA repair proteins XRCC1, ligase IIIα and PARP-1 which are required for the efficient repair of damaged DNA bases and single-strand breaks (SSBs) during base excision repair (BER). In addition, the double-strand break repair protein DNA-PKcs is also not expressed (Bauer et al. 2011; Briegert and Kaina 2007). The attenuated BER and non-homologous end-joining pathways sensitise monocytes to DNA oxidising and alkylating agents while DNA repair competent macrophages and DCs are resistant. As ROS are potent genotoxins, it was addressed whether the oxidative burst of myeloid cells led to DNA damage in the ROS-producing cells (auto-intoxication). It was shown that phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) can stimulate the NADPH oxidase via upstream activation of the protein kinase C. PMA-mediated stimulation of myeloid immune cells, i.e. granulocytes, macrophages and monocytes, led to an increase in intracellular ROS levels. The extracellular ROS burst was detected using a chemiluminescence-based assay. In contrast to T lymphocytes, myeloid immune cells produced massive ROS in a time-dependent manner. It was shown that monocytes, but not macrophages are killed by their own ROS; following PMA treatment and triggering the oxidative burst, cells exhibited oxidative DNA damage and SSB formation followed by cell death. Surviving monocytes were unable to differentiate into macrophages. Furthermore, it was shown that ROS from adjacent cells were also strong enough to damage monocytes (so called ‘killing in trans’). Co-culture experiments with stimulated macrophages or granulocytes and unstimulated monocytes led to DNA damage in monocytes, subsequent activation of the DNA damage response and ultimately monocytic cell death. DNA repair competent macrophages were resistant and did not die. These findings strengthen the hypothesis that the BER-defect of monocytes functions as a regulatory feedback loop in the acute immune response by removing monocytes from the site of inflammation and thus dampening the immune reaction. The analysis of the regulation of the BER protein XRCC1 in monocytes and macrophages was another aspect of this work. It was shown that the demethylation inhibitor 2-hydroxy-glutarate led to an attenuated XRCC1 signal during cytokine-induced differentiation into macrophages. However, the XRCC1 promoter analysis showed no differential methylation pattern between the two cell types. Using a reverse chromatin immunoprecipitation assay coupled with mass spectrometry, potential transcription factors responsible for XRCC1 expression were screened for. Promising candidates were CTCF and AP-1 factors, which were also found by in silico analysis of the promoters of PARP-1, DNA-PK and ligase IIIα. The findings of DNA repair defects in monocytes were extended to neutrophilic granulocytes. It was shown that neutrophils also display severe defects in DNA repair affecting BER and double-strand break repair. Similar to monocytes they do not express XRCC1, PARP-1 and ligase IIIα. Furthermore, DNA damage signalling factors like ATM, p53 and γH2AX were also not detectable. The data indicate a lineage-specific phenomenon.
Das myeloische Immunsystem ist die erste Abwehr bei Infektionen. Die akute Entzündungs-reaktion umfasst die Rekrutierung von Immunzellen zum Entzündungsherd, die Zytokin-Produktion, die Phagozytose vom Fremdmaterial und die Freisetzung von reaktiven Sauerstoff-spezies (ROS), um Pathogene abzutöten. Letzteres wird durch die NADPH-Oxidase vermittelt, die Superoxid-Anionen aus molekularem Sauerstoff generiert und gegen Pathogene freisetzt. Frühere Studien haben gezeigt, dass den Monozyten – nicht aber den Makrophagen oder dendritische Zellen (DC) – die DNA-Reparaturproteine XRCC1, Ligase IIIα und PARP-1 fehlen, welche für die effiziente Basen-Exzisionsreparatur (BER) bei geschädigten DNA-Basen und Einzelstrangbrüchen (ESB) notwendig sind. Des Weiteren wird das Doppelstrangbruch-Reparaturprotein DNA-PKcs nicht exprimiert. (Bauer et al. 2011; Briegert and Kaina 2007). Die beeinträchtigte BER und nicht-homologe Endverknüpfung sensitivieren Monozyten gegenüber oxidierenden und alkylierenden Substanzen, während DNA-reparaturkompetente Makrophagen und DC resistent sind. Da ROS stark genotoxisch sind, wurde untersucht, ob der ‚oxidative burst‘ myeloischer Zellen in den Produzenten zu DNA-Schäden führt (Autointoxikation). Es wurde gezeigt, das Phorbol-12-Myristat 13-Acetat (PMA) die NADPH-Oxidase mittels Aktivierung der Proteinkinase C stimuliert. PMA-vermittelte Stimulation der myeloischen Immunzellen, i.e. Granulozyten, Monozyten und Makrophagen, führte zu einem Anstieg an intrazellulären ROS. Der extra-zelluläre ‚burst‘ wurde über einen Chemilumineszenz-Ansatz gemessen. Im Gegensatz zu T Lymphozyten, produzieren myeloische Immunzellen viel ROS in einer Zeit-Wirkungsbeziehung. Es wurde gezeigt, dass Monozyten, nicht aber Makrophagen, durch ihre eigenen ROS getötet werden; der durch PMA-Behandlung ausgelöste ‚oxidative burst‘ führte in Monozyten zu oxidativen DNA-Schäden und ESB, gefolgt von Zelltod. Die überlebenden Monozyten konnten nicht mehr zu Makrophagen ausdifferenzieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass ROS von benachbarten Zellen stark genug waren, um Monozyten zu schädigen (sog. killing in trans). Co-Kulturexperimente mit aktivierten Makrophagen oder Granulozyten mit nicht-aktivierten Monozyten führten zu DNA-Schäden in Monozyten, der Aktivierung ihrer DNA-Schadensantwort und letztlich zum monozytären Zelltod. DNA-reparaturkompetente Makrophagen waren resistent und starben nicht. Die Ergebnisse untermauern die Hypothese, dass der monozytäre BER-Defekt eine negative Rückkopplungsschleife in der akuten Immunantwort ist, indem er die Monozyten vom Entzündungsherd entfernt und damit die Immunreaktion abschwächt. Ein weiterer Teil dieser Arbeit betraf die Analyse der Regulation des BER-Proteins XRCC1 in Monozyten und Makrophagen. Es wurde gezeigt, dass der Demethylierungsinhibitor 2-Hydroxyglutarat zu einem abgeschwächten XRCC1-Signal während der Zytokin-vermittelten Ausdifferenzierung zu Makrophagen führte. Die XRCC1-Promoteranalyse zeigte jedoch keine Unterschiede im Methylierungsgrad der beiden Zelltypen. Mittels reverser Chromatin-Immun-präzipitation und anschließender Massenspektrometrie wurden potentielle Transkriptions-faktoren verantwortlich für die XRCC1-Expression gesucht. Vielversprechende Kandidaten waren CTCF und AP-1-Faktoren, die auch in der in silico-Analyse der Promotoren von PARP-1, DNA-PK und Ligase IIIα gefunden wurden. Die Erkenntnisse über DNA-Reparaturdefekte in Monozyten wurden auf neutrophile Granulozyten ausgeweitet. Neutrophile wiesen massive Defekte in ihrer DNA-Reparatur, besonders BER und Doppelstrangbruchreparatur, auf. Ähnlich den Monozyten wurden XRCC1, PARP-1 und Ligase IIIα nicht exprimiert. Des Weiteren konnten DNA-Schadensantwortproteine wie ATM, p53 oder γH2AX nicht detektiert werden. Die Daten lassen ein Abstammungslinie-bedingtes Phänomen vermuten.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2635
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: III, 156 Seiten
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