Authors:	Amann, Eva
Title:	Characterization of a murine TCR specific for HLA-A2.1 restricted non-mutated MDM2 peptide for cancer immunotherapy
Online publication date:	5-Mar-2018
Year of first publication:	2018
Language:	english
Abstract:	Adoptive Zelltherapien stellen im Bereich der Krebstherapie vielversprechende immunthera-peutische Ansätze dar. Für den adoptiven T-Zell-Transfer (AZT) wurden autologe T-Zellen verwendet, welche mit T-Zellrezeptoren (TZR) oder chimären Antigenrezeptoren (CAR) modi-fiziert wurden, um gezielt Tumor-assoziierte und Tumor-spezifische Antigene zu erkennen. Der hier beschriebene TZR, spezifisch für ein Tumor-assoziiertes Antigen (TAA), ist ein muriner CD8-restringierter und HLA-A2.1-abhängiger TZR, welcher das humane Protein murine double minute 2 (MDM2) erkennt. Dieser TZR wurde durch Immunisierung von A2kb-transgenen Mäusen mit dem MDM2(81-88)-Peptid generiert. Dieses Peptid ist ein natürlich prozessiertes, nicht mutiertes Peptid, so dass es sich für die Behandlung vieler Tumorentitäten eignet, welche MDM2 überexprimieren, wie zum Beispiel Melanom, Glioblastom, Liposarkom oder multiples Myelom (MM). Zuerst haben wir die für den MDM2-spezifischen Wildtyp (wt) TZR codierende Sequenz mo-difiziert, um die TZR-Expression zu erhöhen und um eine Fehlpaarung von endogenen und transgenen TZR-Ketten zu verhindern und um dadurch Sicherheit und Effizienz des TZR zu er-höhen. Die vollständige Sequenz wurde Codon-optimiert, eine zusätzliche Disulfidbrücke zwischen den konstanten Regionen der α- und β-Ketten des TZR wurde eingebracht und die für die α- und β-Ketten codierenden Bereiche wurden in einen bicistronischen retroviralen Vektor kloniert, welcher ein selbstschneidendes 2A Peptide enthielt. Wir konnten zeigen, dass nach Optimierung die TZR-Expression erhöht war, verglichen mit dem wt TZR, wobei die Affinität des TZR unverändert blieb. Der optimierte TZR erkannte und lysierte spezifisch verschiede MM und Melanom Zelllinien in vitro. Erste in vivo Versuche mit einer MM Zelllinie in einem xenograft Mausmodel hingegen zeigten keine antitumorale Antwort, was vermutlich einer veränderten Antigenexpression und einer erhöhten Expression von inhibitorischen Strukturen auf T-Zellen und Tumorzellen geschuldet war. Das Gesamtüberleben der Mäuse konnte durch einen zweiten TAA-spezifischen TZR und durch die Verwendung der Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) Nivolumab oder Pembrolizumab verlängert werden. In dieser Arbeit haben wir die Antitumor-Effizienz des AZT Verfahrens mittels dualer TAA-spezifischer TZR demonstriert und konnten, in Kombination mit ICIs, das Gesamtüberleben in präklinischen Mausmodellen verlängern. Um eine komplette Remission zu erreichen, wären die Kombination von AZT mit zusätzlichen monoklonalen Antikörpern oder ICIs notwendig. Die auf TZR-basierende und gegen MDM2 gerichtete Immuntherapie ist ein neues potenzielles Verfahren für die Behandlung des MM oder Melanoms. Adoptive cell therapies are promising immunotherapeutic approaches in the field of cancer treatment. To target tumor-associated/specific antigens autologous T cells redirected with T cell receptor (TCR) or chimeric antigen receptor (CAR) were used for adoptive T cell transfer (ACT). The tumor-associated antigen (TAA)-specific TCR described here is a murine TCR recognizing the human protein murine double minute 2 (MDM2) in a CD8-restricted and HLA-A2.1-dependent manner. This TCR has been generated by immunizing A2kb transgenic mice with the MDM2(81-88) peptide, a naturally processed non-mutated peptide which allows the use of MDM2(81-88)-specific TCR for the treatment of multiple cancer types overexpressing MDM2, including melanoma, glioblastoma, liposarcoma or multiple myeloma (MM). First we modified the sequence encoding for the wild type (wt) MDM2-specific TCR to enhance the TCR expression levels and to prevent mispairing of natural and transgenic TCR chains thus increasing the safety and the efficacy of the TCR. The whole TCR sequence was codon-optimized, an additional disulfide-bond was introduced between the constant domains of TCR α- and β-chains and the TCR α- and β-encoding genes were cloned in a 2A self-cleaving peptide-based bicistronic retroviral expression vector. We could show that after optimization, TCR expression was enhanced while the affinity of the TCR remained unchanged compared to the wt TCR. This optimized TCR was recognizing and specifically lysing various MM and melanoma cell lines in vitro. First in vivo studies using a MM cell line in a xenograft mouse model however showed no antitumor response most likely due to tumor antigens expression modulation and up-regulation of inhibitory molecules on the tumor and tumor-infiltrating T cells. By targeting the tumor with a second TAA-specific TCR and immune-checkpoint inhibitors (ICIs) using nivolumab or pembrolizumab the overall survival of mice could be prolonged. In this thesis we demonstrated the anti-cancer efficacy of ACT using dual TAA-specific TCR approach to overcome tumor-antigen escape in combination with ICI which resulted in prolonged overall survival in preclinical mouse studies. To achieve a complete response the combination with additional monoclonal antibodies or ICIs might be necessary. Targeting MDM2 in a TCR-based immunotherapy is a potentially new approach for the treatment of MM and melanoma.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2633
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000019221
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XX, 123 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen